Tách Chiết, Tinh Sạch Và Nghiên Cứu Cấu Trúc Cyclooligomer Depsipeptide Từ Nấm Ký

Hình 1.6. Con đường sinh tổng hợp beauvericin [194]

1.3.4. Nguồn nitơ

Nitơ là yếu tố dinh dưỡng rất quan trọng trong quá trình sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học của vi sinh vật nói chung và nấm ký sinh côn trùng nói riêng. Sự thay đổi về hàm lượng và tính chất của nguồn nitơ có tác động quyết định đến khả năng sinh tổng hợp COD [91, 194, 203]. Như trong quá trình sinh tổng hợp beauvericin ở trên, nguồn nitơ có vai trò cung cấp nitơ cho L-phenylalanin hoặc valine trong quá trình chuyển hóa (Hình 1.6).

Quá trình sinh tổng hợp COD, các chủng nấm nghiên cứu có thể sử dụng được cả nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nitơ vô cơ. Tùy vào mỗi chủng nấm và mỗi loại COD cụ thể sẽ có nguồn nitơ phù hợp khác nhau [68]. Đối với quá trình sinh tổng hợp beauvericin của các nấm chi Fusarium, các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy nguồn nitơ hữu cơ tối ưu là peptone và nguồn nitơ vô cơ tối ưu là NaNO3 [91, 203].

Trong nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enniatins, Buchtová và cs

đã sử dụng đa dạng các nguồn peptone bao gồm peptone từ vi khuẩn, peptone từ đậu nành, bột đậu nành, bột đậu phộng, bột cá, ngô dốc, ngô-gluten, bột ngô, bột yến mạch, tryptone, peptone từ casein, peptone từ casein thủy phân để tăng sản xuất enniatin. Kết quả thí nghiệm không thể hiện rõ ràng sự khác biệt hiệu suất sinh enniatins tổng số khi sử dụng nguồn nitơ có nguồn gốc từ động vật và nguồn nitơ có nguồn gốc từ thực vật. Trong khi peptone từ vi khuẩn, tryptone hoặc peptone từ casein tăng sự sản xuất enniatin của nấm thì peptone từ đậu nành, bột đậu nành, bột đậu phộng, bột cá và ngô kích thích sự tăng trưởng của nấm nhưng hàm lượng enniatins tích lũy được lại giảm [28].

Có thể thấy nguồn nitơ ảnh hưởng rất khác nhau đến sự sinh trưởng cũng như sự sinh tổng hợp COD của nấm ký sinh côn trùng. Việc lựa chọn được nguồn nitơ phù hợp cho cả quá trình sinh trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp COD của nấm rất có ý nghĩa trong công nghệ.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.

1.4. Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng

Cũng như các chất chuyển hóa thứ cấp khác, một quy trình nghiên cứu COD đầy đủ bao gồm các bước phân lập tuyển chọn chủng, tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy, tách chiết và tinh sạch COD, nghiên cứu hoạt tính sinh học, xác định tên và cấu trúc hóa học của COD,… Tách chiết và tinh sạch COD là yêu cầu quan trọng cho tất cả các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng COD sau này.

1.4.1. Tách chiết

Trong hầu hết các tài liệu nghiên cứu đã công bố, để tách chiết COD từ dịch nuôi cấy hoặc sinh khối nấm chủ yếu sử dụng các dung môi hữu cơ. Các dung môi hữu cơ có thể thay đổi tùy từng loại COD cụ thể. Thông thường để tách chiết COD từ sinh khối nấm, dung môi thường được sử dụng nhiều nhất là methanol. Điển hình như trong các nghiên cứu của Xu và cs [201], Supothina và cs [168] hay Vikhe và cs [187], các tác giả đều sử dụng methanol để tách chiết COD từ chủng nấm nghiên cứu.

Ngoài ra cũng có các nghiên cứu sử dụng các loại dung môi khác như ethanol, methylene chloride, acetone,…[62, 83]. Hầu như các nghiên cứu đều sử dụng dung môi ethyl acetate để tách chiết COD trong dịch nuôi cấy [112, 168].

Việc lựa chọn dung môi tách chiết căn cứ vào độ phân cực của từng loại COD cụ thể. Mỗi loại COD có độ phân cực nhất định vì thế khả năng hòa tan trong các dung môi có độ phân cực khác nhau là rất khác nhau. Thông thường, khi tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thiên nhiên nói chung và COD nói riêng, các nhà nghiên cứu sẽ lần lượt khảo sát lựa chọn các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (từ kém phân cực đến phân cực mạnh). Dung môi tách chiết ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả của quá trình tách chiết tinh sạch COD từ nấm. Khi nghiên cứu về sự sinh tổng hợp COD của nấm Conidiobolus coronatus, Paszkiewicz và cs đã so sánh hiệu quả tách chiết một số COD như enniatin A, enniatin B và beauvericin từ chủng nghiên cứu của ba hệ dung môi ethyl acetate, ACN: MeOH: H2O (16:3:1) và MeOH: H2O (7:3). Kết quả cho thấy ở cả ba loại COD thì hệ dung môi ACN: MeOH: H2O (16:3:1) là hiệu quả nhất, dung môi ethyl acetate là kém hiệu quả nhất [133].

1.4.2. Tinh sạch

Quá trình tinh sạch COD là quá trình phức tạp, bao gồm nhiều phương pháp khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp tinh sạch cụ thể phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của các COD đó. Tuy nhiên, nhìn chung hiện nay có rất nhiều các phương pháp sắc ký khác nhau đang được ứng dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu về tinh sạch COD.

Sắc kí là kĩ thuật được dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng sự tương tác giữa hai pha: pha tĩnh là chất hấp phụ và pha động là dung môi. Pha động mang mẫu di chuyển qua pha tĩnh và dựa vào khả năng hấp phụ khác nhau của các chất với pha tĩnh mà các chất được tách ra khỏi hỗn hợp. Quá trình tinh sạch COD cần phải nghiên cứu tìm ra pha tĩnh và pha động phù hợp với khối lượng phân tử, tính phân cực, khả năng hòa tan trong dung môi của từng COD cụ thể [38].

Có nhiều phương pháp sắc kí như sắc kí giấy, sắc kí bản mỏng, sắc kí cột, sắc kí lỏng cao áp… Căn cứ vào mục đích và thành phần chất cần tách mà sử dụng các phương pháp sắc kí thích hợp. Các phương pháp sắc kí giấy, sắc kí bản mỏng thường được dùng để nhận biết các chất có trong hỗn hợp và tìm ra phương pháp chạy sắc kí cột, còn sắc kí cột, sắc kí lỏng điều chế dùng để tách các chất ra khỏi hỗn hợp. Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) là phương pháp hiện đại và hiệu quả trong nghiên cứu [212].

Với các phương pháp kể trên, rất nhiều chất COD đã được tinh sạch và ứng dụng vào thực tiễn như sử dụng. Ví dụ như nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa sắc ký cột và HPLC tinh sạch beauvericin thu được từ nấm Cordyceps militaris của Rachmawati và cs, hay nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC để tinh sạch COD trong nghiên cứu của Vikhe và cs… [139, 187].

Cụ thể khi tinh sạch beauvericin từ sinh khối nấm Cordyceps militaris, Rachmawati và cs sử dụng sắc ký cột pha đảo để tinh chiết cao chiết thô với

hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7,

2:8, 1:9, 0:10). Hợp chất rửa giải cuối cùng là ethyl acetate 90% và 100% thu hai phân đoạn. Hai phân đoạn này tiếp tục được tinh chế bằng các kỹ thuật sắc ký khác. Kết quả thu được hợp chất beauvericin tinh khiết [139].

Có thể nói, sắc ký kỹ thuật là phương pháp phổ biến để tinh sạch các hợp chất tự nhiên nói chung và các hợp chất COD nói riêng hiện nay.

1.4.3. Nghiên cứu cấu trúc

Khi có được COD sạch cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học hay nghiên cứu ứng dụng, một bước quan trọng cần được tiến hành tiếp theo là xác định công thức phân tử, cấu trúc hóa học và tên của hợp chất COD đó.

Để xác định công thức phân tử và công thức cấu tạo của các hợp chất thiên nhiên nói chung và của các COD nói riêng, các nhà khoa học thường sử dụng các phương pháp xác định điểm nóng chảy (mp), độ quay cực ([α]D, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều,…. Bằng việc phân tích kết quả tổng hợp của các phương pháp phổ sẽ xác định được công thức phân tử, cấu trúc hóa học của COD [26]. Các nghiên cứu về xác định cấu trúc COD hầu như đều sử dụng các phương pháp này.

Điển hình như khi nghiên cứu cấu trúc chất sạch COD được tách chiết và tinh sạch từ sinh khối nấm Fusarium oxysporum, Zhang và cs đã tiến hành chụp các phổ HRESI-MS, 1H và 13C NMR, ESI-MS/MS, phổ DEPT và HSQC. Qua phân tích phổ xác định được chính xác tên của hợp chất COD từ chủng nấm nghiên cứu là beauvericin, xác định được cấu trúc của beauvericin đã tinh sạch được [215]. Tương tự trong các nghiên cứu cấu trúc các hợp chất COD từ nấm ký sinh côn trùng của Ahn và cs (2006) [15], Sood và cs (2017) [163],… các tác giả đều sử dụng các phương pháp như trên.

Xác định công thức hóa học, cấu trúc phân tử của các hợp chất dựa trên các phương pháp xác định điểm nóng chảy (mp), độ quay cực ([α]D, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều… là phương pháp hiện đại, đáng tin cậy, đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu sử dụng. Hiện chưa có các phương pháp nào thay thế các phương pháp này trong nghiên cứu hóa học hữu cơ hiện nay.

1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

Từ các nghiên cứu đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ trước, trải qua hơn 70 năm đã có khá nhiều nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng sinh COD công bố trên thế giới. Hầu hết các nghiên cứu tập trung vào ba hướng cơ bản: Tìm kiếm các hoạt chất COD mới, tìm kiếm các loài mới, chủng mới có khả năng sinh tổng hợp COD; nghiên cứu hoạt tính sinh học của COD và ứng dụng COD; quá trình sinh tổng hợp COD, cải tiến công nghệ nuôi cấy, công nghệ lên men nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất COD.

Tìm kiếm các hoạt chất COD mới, tìm kiếm các loài mới, chủng mới có khả năng sinh tổng hợp COD là hướng nghiên cứu xuyên suốt kéo dài trong suốt hơn 70 năm qua. Enniatin và beauvericin là những COD đầu tiên được tìm thấy và nghiên cứu. Tiếp theo, hàng loạt các beauvericina-n, enniatina-n và các COD khác như allobeauricina-n, bassianolide, bassiatin, lateritin, PF1022a- n, hirsutellide, verticilidesa-n, cardinalisamidea-n… lần lượt được phát hiện, phân lập và xác định cấu trúc. Và gần đây nhất, sáu hợp chất COD mới là pseudoxylallemycin (A-F) được phân lập từ chi nấm Pseudoxylaria được công bố [13, 216]. Bên cạnh việc tìm kiếm các hoạt chất COD mới, việc tìm kiếm các nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp COD cũng được chú trọng. Trước đây, nguồn vi sinh vật chủ yếu được nghiên cứu để phân lập chủ yếu tập trung chủ yếu ở bốn chi nấm ký sinh côn trùng như Beauveria, Fusarium, Paecilomyces, Verticillium. Gần đây, các nhà khoa học không ngừng tìm

kiếm các loài mới, chủng mới có khả năng sinh tổng hợp COD. Hàng loạt các nghiên cứu sinh tổng hợp COD từ các loài thuộc các chi nấm khác nhau như Acremonium, Hirsutella, Isaria, Halosarphia, Xylaria, Aspergillus, Trichoderma… được công bố. Thậm chí cũng có công bố phân lập được COD từ các chi rất hiếm khi được ghi nhận về khả năng sinh tổng hợp COD như Cordycep, Pseudoxylaria. Điển hình như nghiên cứu của Wang và cs (2014), Rachmawati và cs (2017), Abdalla và cs (2018)… [13, 139, 193]

Nghiên cứu hoạt tính sinh học và ứng dụng COD hiện cũng là hướng nghiên cứu tiềm năng và các nghiên cứu về vấn đề này ngày càng tăng trong 10 năm trở lại đây. Có thể thấy sự khác biệt rõ rệt của các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của COD và ứng dụng COD ở hai giai đoạn trước năm 2000 và từ sau năm 2000 đến nay. Trước năm 2000, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hoạt tính diệt côn trùng, khả năng kháng vi sinh vật của COD. Ứng dụng chủ yếu COD là trong lĩnh vực nông nghiệp. Tiêu biểu như beauvericin và sinh khối của nấm Beauveria bassiana được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm trừ sâu hại nhờ hoạt tính diệt côn trùng mạnh đối với phổ rộng các loại côn trùng gây hại [54, 60, 64, 79]. Từ những năm 2000 trở lại đây, các nghiên cứu tập trung vào các hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và các hoạt tính khác như chống sốt rét, chống nhiễm trùng [74, 167, 190, 191]; chống dị ứng [206]; diệt giun sán [129]; hay ức chế sự hoạt động của enzyme cholesterol acyltransferase (ACAT) từ đó hạn chế sự hình thành các amyloid ở người bệnh Alzheimer [128, 177]… Đặc biệt, hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của các COD được chú ý trong 10 năm trở lại đây. Hàng loạt các nghiên cứu về khả năng ức chế của các COD đối với sự phát triển của trên dưới 20 dòng tế bào ung thư khác nhau đã được công bố (Bảng 1.2) [131, 137, 194]. Các nghiên cứu cho thấy các hợp chất COD có tiềm năng ứng dụng trong y học, đặc biệt là

trong điều trị các bệnh nan y như ung thư. Tuy nhiên trên thực tế, tính đến thời điểm hiện tại chưa có ghi nhận cụ thể nào về ứng dụng COD trong lĩnh vực này.

Ngoài ra quá trình sinh tổng hợp COD, cải tiến công nghệ nuôi cấy, công nghệ lên men nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất COD cũng đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều nghiên cứu về cơ chế sinh tổng hợp COD. Cơ chế sinh tổng hợp COD được biết đến nhiều nhất hiện nay là mô hình giả thuyết được đề cập trong các nghiên cứu của Sussmuth và cs (2011), Yu và cs (2017), Steiniger và cs (2017), Boeker và cs (2018) (xem mục 1.2.2) [25, 164, 169, 209]. Sản xuất COD được nghiên cứu theo hai hướng chính là tổng hợp nhân tạo từ nguồn hóa chất và sản xuất COD từ các chủng vi sinh vật. Đầu tiên là tổng hợp COD nhân tạo từ các nguồn hóa chất. Các COD phổ biến như beauvericins, enniatins, verticilides hay bassianolide được tổng hợp nhân tạo từ các loại hóa chất cụ thể. Điển hình như nghiên cứu của Hu và cs (2012) [71], Lücke và cs (2016) [104]. Tuy nhiên, quá trình tổng hợp nhân tạo COD thường gặp khó khăn ở các khâu như N-metyl hóa các amino acid, sự phân hóa trong quá trình kết hợp các hydroxyl acid cũng như ở khâu tạo cấu trúc vòng [160]. Hơn nữa, quá trình tổng hợp nhân tạo đòi hỏi lượng dung môi cao, chất xúc tác tốn kém dẫn đến hạn chế lớn về mặt kinh tế [117]. Chính vì vậy, mặc dù sản lượng COD thu được không cao như tổng hợp nhân tạo nhưng sản xuất COD là sản phẩm tự nhiên bằng cách nuôi cấy, lên men các chủng vi sinh vật là một hướng nghiên cứu khá bền vững, đã và đang thu hút được sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới. Tiêu biểu như những nghiên cứu về sản xuất COD từ các chủng nấm thuộc chi Fusarium [162, 203]. Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp các COD tự nhiên còn nhiều thách thức. Mặc dù các COD đã biết hiện nay có phổ hoạt tính sinh học rộng, rất tiềm năng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong y học, cũng như rất đa dạng