Trang chủ / Tài liệu miễn phí / Luận Án Tiến Sĩ Sinh Học

Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Theo Phương Pháp Mtt


Thu mẫu để xác định sinh khối khô (CDW) đánh giá sự sinh trưởng và xác định hàm lượng COD được tổng hợp từ chủng vi nấm.

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Sau khi có được nguồn cacbon phù hợp, bổ sung 5% chủng vi nấm đã hoạt hóa 36 giờ vào trong bình tam giác chứa 25ml môi trường thu sinh khối với các nguồn Nitơ khác nhau: NaNO3, cao nấm men, pepton, cao thịt, KNO3, NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4HCO3, MSG. Nuôi trong tủ lắc và lắc với

tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 250C. Sau 6 ngày, xác định CDW và hàm

lượng COD tạo ra.

2.2.1.7. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp MTT

Các dòng tế bào Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - TB ung thư gan); PC-3 (Human Prostate Adenocarcinoma - TB ung thư tuyến tiền liệt); Vero (kidney, African green monkey - tế bào thường) được nuôi cấy ở 37oC, CO2 5% trong môi trường phù hợp: DMEM (Dulbecco‟s Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle‟s Minimum Essential Medium, Sigma-Aldrich, USA) hoặc RPMI 1640 (ThermoFisher, Waltham, CHLB Đức) có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê 5-10%. Dịch tế bào sau đó được nhỏ lên phiến vi lượng 96 giếng, ủ với các mẫu thử ở dải nồng độ từ 1006,25µg/ml đối với mẫu cao chiết hoặc 501µg/ml (µM) đối với chất tinh sạch, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Ellipticine hoặc Paclitaxel (Taxol) trong DMSO được dùng làm chất chuẩn dương tính (+). Sản phẩm chuyển hóa dạng tinh thể formazan được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) và đo mật độ quang ở λ = 540/720 nm trên thiết bị Infinite F50 (Tecan, Männedorf, Thụy Sỹ) [114, 120].

Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư ở nồng độ nhất định của chất thử tính theo % so với đối chứng theo công thức:

Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [1-(OD[mẫu]/OD[đối chứng (-)])] Độ lệch tiêu chuẩn được tính theo công thức:



xi x^ 2/n1


Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥ 50%) được xác định giá trị IC50 (μg/ml hoặc μM) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của tế bào, sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Các thử nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.1.8. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật ki m định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của McKane & Kandel [110, 185].

Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923, Bacillus subtillis ATCC 11774, Staphylococcus aureus subsp. Aureus ATCC 11632, Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M42, Candida albicans ATCC 7754, Saccharomyces cerevisiae SH 20.

Chứng dương: Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+), Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-), Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp. Chứng âm: Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.

Môi trường duy trì và bảo tồn giống: SDB cho nấm men và nấm mốc, TSB cho vi khuẩn. Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.

Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng theo tiêu chuẩn McFarland 0,5 rồi tiến hành thí nghiệm. Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Các


mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ ở đó vi sinh vật bị ức chế gần như hoàn toàn.

Các thử nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.1.9. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hóa [27, 59, 88]. Chất thử được hòa trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96%. Mẫu được pha trong DMSO 100% với nồng độ 4mg/ml đối với dịch chiết thô và 1mg/ml với mẫu tinh sạch. Sử dụng flavonoid 1 mM hoặc axit ascorbic 5 mM trong DMSO 10% làm đối chứng dương. Mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH để được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200 μg/mL đến 12,5 μg/mL (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 μg/mL đến 3,1 μg/mL (mẫu tinh sạch). Ủ ở 37oC trong 30 phút và đo mật độ quang (OD) ở

bước sóng λ= 515 nm trên thiết bị đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ).

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%): Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức:

Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau Xác định SC 50 1

Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau:



Xác định SC50: Mẫu (chất thử) được pha loãng thành các nồng độ giảm dần, lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ. Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bởi DPPH của mỗi mẫu được tính dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank)


và chứng âm tính. Mẫu có biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để tìm giá trị IC50 (μg/mL, μM/mL). Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.

Các thử nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1.Tách chiết ADN tổng số

Nuôi cấy chủng tuyển chọn trên môi trường Sabouraud lỏng, trong 48 giờ. Thu sinh khối nấm cho vào eppendorf (200mg/chủng), siêu âm 10-30 giây tùy chủng. Bổ sung 600µl đệm SDS vào ống chứa mẫu, ủ 60-700C trong 15-60‟. Thêm 300µl Natri acetate 3M (pH 5,2). Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20‟ ở 40C, hút dịch nổi chuyển sang eppendorf mới. Bổ sung isopropanol lạnh (tỷ lệ 1:1). Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ dịch, thu kết tủa. Rửa kết tủa bằng 500 µl ethanol 70%, để khô 10-15‟. Bổ sung 50

µl đệm TE (Tris-EDTA, pH 8). Thêm 3 µl RNase (10mg/ml) ủ ở 60oC trong

30‟, bảo quản ADN ở 0-4oC [49].

2.2.2.2. Nhân bội ADN

ADN tổng số được sử dụng để tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn vùng ITS với cặp mồi ITS4 - ITS5 [142], vùng LSU với cặp mồi LROR-LR7 [188], và vùng Rpb1 với cặp mồi Crpb1A-RPB1Cr [33]. Sử dụng bộ kit “Dream Taq PCR Master Mix (2X)” (Thermo Fisher Scientific, USA). Biến tính DNA ở 95oC trong 3‟. Lặp lại 35 chu kỳ với chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: (1) Giai đoạn biến tính DNA ở 95oC trong 30”. (2) Giai đoạn bắt cặp mồi ở 48oC trong 30”. (3) Giai đoạn kéo dài: 72oC trong 1‟40”. Giai


đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng là 8 phút ở 72oC và 4oC (∞). Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với điện áp 80V trong 60 phút và hiện hình ảnh sản phẩm dưới tia UV.

2.2.2.3. Phương pháp giải trình tự

Sản phẩm PCR được giải trình tự (Công ty First BASE - Singapore). Kết quả được phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.2 [63] và so sánh với các trình tự ADN liên quan lấy từ ngân hàng gen NCBI thông qua công cụ tìm kiếm Blast. Các trình tự liên quan được dóng hàng với trình tự nghiên cứu sử dụng phần mềm ClustalX1.83 [175] và được sử dụng để phân tích mối quan hệ phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại. Kết quả phân tích trình tự gen sẽ cho phép xác định và kết luận mối quan hệ giữa các loài nghiên cứu, cây tiến hóa được hiển thị bằng phần mềm Mega X [89].


Bảng 2.2. Các trình tự được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài trên ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1

Tên loài

Ký hiệu chủng

Đoạn gen

ITS

LSU

Rpb1

C. cateniannulata

CBS152.83

-

NG067333.1

-

C. cateniannulata

NTUCC18-108

MT966056.1

MT974270.1

-

C. cateniannulata

NTUCC18-109

-

MT974273.1

-

C. cateniannulata

NTUCC18-110

-

MT974275.1

-

C. cateniannulata

NTUCC18-111

-

MT974310.1

-

C. cateniannulata

TBRC7258

MF140753.1

MF140729.1

MF140767.1

C. farinose

CBS262.58

AY624179.1

MH869308.1

MF416654.1

C. fumosorosea

BCC20180

MH532834.1

MH394654.1

MH521837.1

C. militaris

NBRC9787

JN943433.1

JN941384.1

JN992491.1

C. militaris

NBRC100741

JN943437.1

JN941386.1

JN992489.1

C. nipponica

NBRC101406

JN943301.1

JN941388.1

JN992487.1

C. nipponica

NBRC101407

JN943392.1

JN941389.1

JN992486.1

C. takaomontana

BCC12688

EU807996.1

MF416545.1

MF416646.1

C. tenuipes

BCC34337

MH532861.1

MH394665.1

MH521839.1

C. tenuipes

NHJ12337

JN942617.1

-

-

C. tenuipes

TBRC7265

MF140741.1

MF140707.1

MF140776.1

H. atrovidis

NBRC8436

JN943354.1

JN941450.1

JN992425.1

H. gelatinosa

NBRC9060

JN943357.1

JN941452.1

JN992423.1

I. cateniannulata

BCMUIF05

AB263742.1



I. farinose

CBS111113

AY624181.1

MF416554.1

MF416656.1

I. farinose

CBS240.32

AY624178.1

JF415979.1

JN049895.1

I. farinose

CBS262.58

AY624179.1



I. tenuipes

NHJ12337

JN942617.1

JN940905.1

JN987883.1

O. myrmecophila

BCC82258

MH028147.1

MH028159.1

MH028171.1

O. nutans

NBRC101749

AB968408.1

JN941429.1

JN992446.1

O. sphecocephata

NBRC101416

IN943348.1

JN941443.1

JN992432.1

S. hepialid

RCEF3666

MW031744.1

MW045188.1

MW080845.1

S. hepialid

RCEF3890

MW031745.1

MW045189.1

MW080846.1

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.

Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn - 8


2.2.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide

2.2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ sinh khối nấm

Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết sinh khối nấm được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck) và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck).

Sắc ký lớp mỏng (TLC): bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck) và RP-18 F254S (0,25 mm; Merck).

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột thường với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh) của Merck. Sắc ký cột ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20. Sắc ký cột pha đảo dùng loại YMC RP-18 có cỡ hạt là 30-50 μm (Fuji Silysia Chemical Ltd.).

Sắc kí lỏng kết nối khối phổ HPLC - MSD: Agilent 1200 Ion Trap của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

2.2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất sạch

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được sử dụng các thiết bị hiện đại. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm:

Đi m nóng chảy (mp): Đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Độ quay cực ([α]D): Đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối lượng (MS): Phổ khối (phun mù điện tử) ESI-MS được đo trên máy Agilent 1200 TRAP. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Đo trên máy Bruker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC,….

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD và CDCl3.

2.2.3.3. Thực nghiệm tách chiết, tinh sạch hợp chất COD từ sinh khối nấm C. cateniannulata CPA14V

Bảng 2.3. Phương pháp thực nghiệm khảo sát và thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh sạch COD

Thực nghiệm khảo sát

Thí nghiệm sau khảo sát

Bước 1: Chủng nấm C. cateniannulata CPA14V sau khi được hoạt hóa, được nuôi cấy trong môi trường CzD sử dụng nguồn cacbon là glucose, nguồn nitơ là NaNO3, độ pH môi trường bằng 8 trong 6 ngày, lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC. Sinh khối nấm rửa sạch bằng nước lọc rồi đem đông khô bằng máy đông khô

Flexi Dry (Mỹ)

Bước 1: Chủng nấm C. cateniannulata CPA14V sau khi được hoạt hóa, được nuôi cấy trong môi trường CzD sử dụng nguồn cacbon là glucose, nguồn nitơ là NaNO3, độ pH môi trường bằng 8 trong 6 ngày, lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC. Sinh khối nấm rửa sạch bằng nước lọc rồi đem đông khô bằng máy đông khô

Flexi Dry (Mỹ)

Bước 2: Ngâm chiết 25g sinh khối khô nấm C. cateniannulata CPA14V với dung môi ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC thu được cao chiết tổng ethanol (CCM) dùng

làm nguyên liệu để phân lập và tinh

Bước 2: Sinh khối (25g) ngâm chiết 5 lần với dung môi dichloromethane trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng dichloromethane thu được cất kiệt dung môi bằng máy cất quay chân không IKA RV 06-MT dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC

thu cao chiết tổng dichloromethane

Xem tất cả 228 trang.

Ngày đăng: 12/02/2023
Trang chủ Tài liệu miễn phí