Phương Pháp Tuy N Chọn Chủng Nấm Sinh Cyclooligomer Depsipeptide

các loài có khả năng sinh COD nhưng hiện có rất khó có thể sản xuất COD ở quy mô công nghiệp. Các chủng nấm sản xuất tự nhiên thường có những điểm bất lợi trong quá trình ứng dụng vào sản xuất như tốc độ sinh trưởng của nấm chậm, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu thấp. Đặc biệt, hầu hết các chi nấm có khả năng sinh tổng hợp COD đều có thể gây bệnh cho người và động vật, khó sửa chữa về mặt di truyền. Chính vì vậy, gần đây bắt đầu có các nghiên cứu về sản xuất COD từ các vi khuẩn chuyển gen như Escherichia coli [205], Bacillus subtilis [221] và Saccharomyces cerevisiae [210].

Ở Việt Nam, hiện chưa có các nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD và ứng dụng COD được công bố. Các nghiên cứu đã công bố có liên quan ở Việt Nam không đi theo hướng chủ động tìm kiếm loài mới, chủng mới có khả năng sinh tổng hợp COD cụ thể hoặc tìm kiếm hoạt chất COD mới, mà chủ yếu tập trung theo hướng đánh giá sự đa dạng một chi, họ hoặc bộ nấm ký sinh côn trùng cụ thể ở khu vực nhất định và khảo sát một số hoạt chất của chúng. Tiêu biểu như nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại vườn quốc gia Cát Tiên - nguồn tài nguyên quý cho các ứng dụng sinh học của tác giả Lê Tấn Hưng [172], hay các nghiên cứu về đa dạng nấm Cordyceps takaomontana và khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học có giá trị của các tác giả như Nguyễn Thị Thanh Lan [4], Đinh Minh Hiệp [69]… Hiện nay chưa có nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng sinh COD cũng

như về hoạt tính sinh học của COD và ứng dụng COD được công bố. Các nghiên cứu liên quan chủ yếu là sử dụng sinh khối nấm có chứa COD để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu như nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất hai chế phẩm trừ sâu sinh học Ometar và Biovip” của các tác giả Nguyễn Thị Lộc [3], “Nghiên cứu phát triển các nguồn nấm côn trùng Beauveria, Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng, cây rừng, và phát triển nguồn nấm Cordyceps sp. làm thực phẩm chức năng cho con người” của tác giả Phạm Thị Thùy [10],

“Nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana phòng chống rệp sáp hại cà phê tại Tây Nguyên” của tác giả Phạm Văn Nhạ [6]...

Tương tự về quá trình sinh tổng hợp COD, cải tiến công nghệ nuôi cấy, công nghệ lên men nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất COD. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về quá trình sinh tổng hợp COD, công nghệ lên men, tách chiết và tinh sạch COD từ nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam. Các công trình liên quan đến sản xuất COD chủ yếu theo hướng nuôi trồng thu thể quả có chứa COD trên các nền cơ chất khác nhau. Tiêu biểu là nghiên cứu “Phân lập nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp. giàu hoạt chất beauvericin từ vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An” của tác giả Nguyễn Thị Thanh Lan và cs [4]. Mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu về COD và ứng dụng COD ở Việt Nam, nhưng với lợi thế đa dạng và phong phú nguồn vi sinh vật đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng, COD và ứng dụng COD sẽ là hướng nghiên cứu tiềm năng cho các nhà khoa học ở Việt Nam trong thời gian tới.

Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật. Có khá nhiều nghiên cứu về đa dạng các loài thực vật, động vật và côn trùng ở đây. Tuy nhiên hiện nay, hầu như không có các nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD ở hai khu vực này.

Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (KBTTN Copia) thuộc huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La, cách thành phố Sơn La 70km về phía Đông, được giới hạn bởi vị trí 21o15‟ đến 21o25‟ vĩ độ Bắc, 103o30‟ đến 103o44‟ kinh độ Đông với tổng diện tích 19.745ha, trong đó 13.426 ha là rừng tự nhiên. Khu Bảo tồn Copia có địa hình các dãy núi đá vôi chiếm phần lớn diện tích, chạy theo hướng Tây Bắc - Đông Nam và có nhiều đỉnh núi cao trên 1500m như

Copia, Trông Sia, Long Nọi... Khu vực Copia có hệ thống suối khá phong phú như suối Nậm Nhộp, Nậm Lu, Hủa Lương, Hủa Nhử,... tạo nên sự đa dạng, hài hòa của thiên nhiên, thuận lợi cho sinh vật phát triển phong phú [5]. Nhiệt độ trung bình năm tại Copia tương đối thấp (khoảng 19oC), lượng mưa trung bình ở khu vực trung bình 1.500-1.600mm/năm, tập trung từ tháng 5 đến tháng 8. Độ ẩm bình quân khoảng 85% Hiện tượng thời tiết cực đoan như sương muối và băng giá thường xuyên xuất hiện[7]. Thảm thực vật ở Khu Bảo tồn Copia phong phú và đa dạng, có 609 loài thực vật thuộc 406 chi,

149 họ, 5 ngành. Về động vật, Khu bảo tồn hiện ghi nhận 65 loài thú thuộc 25 họ, 8 bộ. Khu hệ chim gồm 14 bộ (chiếm 73,68%) số bộ cả nước, 47 họ chiếm 57,31% số họ, 184 loài chiếm 22,22% số loài cả nước bao gồm 134 loài định cư, có 26 loài di cư theo mùa, có 14 loài vừa di cư vừa định cư. Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia có 58 loài bò sát và ếch nhái, chiếm 10,55% số loài lưỡng cư bò sát ở Việt Nam; trong đó lớp lưỡng cư có 22 loài, thuộc 6 họ, 1 bộ; lớp bò sát có 36 loài, thuộc 12 họ, 2 bộ [2, 8]. Hiện nay mới có một vài ghi nhận về nấm ở Copia [11, 12, 184].

Vườn quốc gia Xuân Sơn (VQG Xuân Sơn) thuộc huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ, miền Bắc Việt Nam, được giới hạn bởi vĩ độ 21o039 - 21o129 N và kinh độ 104o519 - 105o019 E, với diện tích 15.048 ha trong đó bao gồm 9.099 ha khu bảo vệ nghiêm ngặt, 5.737 ha rừng phục hồi và 212 ha hành chính dịch vụ [9]. Vườn quốc gia Xuân Sơn có địa hình núi đất xen kẽ núi đá vôi, cao dần từ đông sang tây và từ nam lên bắc (từ 200-1386m), có độ dốc lớn. Vùng núi đá vôi có diện tích 1.661 ha, chiếm 30% diện tích của VQG, với nhiều hang động. Hệ thống sông suối của VQG Xuân Sơn khá dày với tổng chiều dài 120 km và chiều rộng trung bình của các sông là 150m. Các kiểu thảm thực vật tự nhiên ở Xuân Sơn là rừng thường xanh đất thấp và núi thấp, rừng núi đá vôi vùng đất thấp và núi thấp [223]. Khí hậu khu vực

VQG Xuân Sơn thuộc vùng nhiệt đới gió mùa với mùa mưa và mùa khô rõ rệt. Nhiệt độ trung bình quanh năm từ 22 - 23oC; lượng mưa trung bình hàng năm là 1.826 mm (từ tháng 4 đến tháng 10, chiếm 90% lượng mưa cả năm). Độ ẩm trung bình hàng năm là 86% [223]. Vườn quốc gia Xuân Sơn là nơi sinh sống của một số loài động thực vật. Hiện có 365 loài động vật được tìm thấy trong khu vực, chẳng hạn như voọc, vượn, cầy hương, gấu, sóc, gấu, báo, gà lôi và gà lôi công, những loài thường đến từ vùng Tây Bắc. Các loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cũng được bảo tồn tại vườn, trong đó có 46 loài

nằm trong Sách Đỏ Việt Nam và 18 loài trong Sách Đỏ Thế giới. Hệ thực vật của VQG Xuân Sơn rất phong phú và đa dạng, bao gồm 180 họ, 680 chi và

1.217 loài thuộc họ thực vật 6 bậc có mạch [223]. Một số nghiên cứu về nấm, các loài nấm được ghi nhận thuộc chi Isaria [12].

Có thể thấy với sự đa dạng nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD, đa dạng các hợp chất COD cùng phổ hoạt tính sinh học rộng có tiềm năng ứng dụng cao, đa dạng thì nấm ký sinh côn trùng sinh COD vẫn luôn là hướng nghiên cứu bền vững, triển vọng trong tương lai. Việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng sinh COD ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn là vấn đề cần được quan tâm nhằm bổ sung các hiểu biết về nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD từ nấm ký sinh côn trùng, góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học các loài nấm ký sinh côn trùng tại hai khu vực này.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là nấm được phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ).

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

- Hóa chất: KCl, NaCl, CaCl2, NaNO3, ZnSO4.7H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4.7H2O, KNO3, NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4HCO3,

MSG , pepton, cao nấm men, cao thịt, glucose, fructose, saccharose, lactose, tinh bột tan, galactose, manitose, chloroform, acetonitrile (Merck, Đức), ethanol, methanol (Merck, Đức), hexan, ethyl acetate, natri acetate, agar, L-glutamine, penicillin, streptomycin sulfate, chloramphenicol, streptomycin, tetracyclin, nystatin, amphotericin B, dimethyl sulfoxide, ethidium bromide, beauvericin (Sigma, Mỹ), silica gel (Merck, Đức), YMC RP 18 (Merck, Đức), sephadex LH-20 (Merk, Đức), bản mỏng tráng sẵn 60 F254 và RP-18 F245S (Merck, Đức)…

- Thiết bị: Nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy so màu (UV- vis, Nhật); máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ); tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); máy li tâm (Sorvall, Mỹ); kính hiển vi Olympus CX31, cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sĩ); máy lắc ổn nhiệt (BR300LF, Nhật), micropipet (Gilson, Pháp) các loại từ 10µl- 1ml, máy PCR (Applied biosystems, Mỹ), máy đông khô (Flexi Dry, Mỹ), máy sắc ký hiệu năng cao HPLC Ultimate 3000 (Thermo, Mỹ) và các dụng cụ thông dụng khác của phòng CNSH - Vi sinh, khoa sinh học, Đại học Sư Phạm Hà Nội. Máy sắc ký lỏng khối phổ HPLC - MSD, máy Kofler micro-hostage, máy JASCO DIP-1000KUY, máy FT-ICR- Mass spectrophotometer, máy Bruker avance 500 MHz và các dụng cụ thông dụng khác của Viện hóa học và hợp chất thiên nhiên và Viện hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

2.1.3. Môi trường

Môi trường phân lập (Môi trường Sabouraud bổ sung cloramphenicol): 40g/l glucose; 20g/l peptone; 20g/l agar; 0,2g/l chloramphenicol; pH=5,6; nước cất 1000ml.

Môi trường nuôi cấy và giữ giống (Môi trường Sabouraud): 40g/l glucose; 20g/l peptone; 20g/l agar; pH=5,6; nước cất 1000ml.

Bảng 2.1. Môi trường lên men thu nhận COD

Thành phần	PGB	SBR	MM	CzD	FDM
1	Glucose (g)	20	40	20
2	Sucrose (g)				30	25
3	Khoai tây (g)	250
4	Cao nấm men (g)			1
5	Pepton (g)		10
6	NH4NO3 (g)			3
7	NaNO3 (g)				3,5	4,25
8	KH2PO4 (g)			0,5		1,36
9	K2HPO4 (g)				1,5
10	MgSO4.7H2O (g)			0,5	0,5	2,5
11	FeSO4.7H2O (g)				0,1	0,01
12	ZnSO4.7H2O (g)					0,029
13	CaCl2 (g)			0,5
14	KCl (g)				0,5g
15	NaCl (g)					5g
16	H2O (ml)	1000	1000	1000	1000	1000

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật học

2.2.1.1. Phương pháp phân lập

Mẫu côn trùng được loại bỏ đất, sau đó cắt một phần mẫu khoảng 1-2 cm mọc trên kí chủ khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri hypoclorit 1% trong 2 phút và được rửa lại bằng nước vô trùng 05 lần, sau đó được để trong cối sứ vô trùng. Bổ sung 45 ml nước cất vô trùng vào cối sứ.

Mẫu nấm được nghiền đến khi tạo thành dạng huyền phù. 0,1 ml dịch huyền phù được hút và trải đều trên các đĩa Petri chứa môi trường Sabouraud vô trùng. Phần kí chủ còn lại được ngâm trong dung dịch natri hypoclorit 1% trong 2 phút sau đó lấy phần hệ sợi nấm bên trong kí chủ ra và cấy trên môi trường Sabouraud vô trùng. Các đĩa nấm được nuôi cấy ở 25-28oC và quan sát đặc điểm trong khoảng thời gian từ 3-14 ngày. Các khuẩn lạc nấm riêng rẽ được tách và lưu giữ trong môi trường Sabouraud để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo [147].

2.2.1.2. Phương pháp giữ giống

Phương pháp cấy truyền định kỳ: Tiến hành cấy truyền các chủng nấm giống định kỳ 2 tháng một lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường Sabouraud, đặt ở nhiệt độ 25oC, sau 5 - 7 ngày nấm đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC.

2.2.1.3. Phương pháp hoạt hóa chủng nấm đ tuy n chọn

Chủng nấm đã bảo quản lạnh trong môi trường thạch được hoạt hóa bằng cách chuyển sang môi trường Sabouraud có bổ sung cloramphenicol 0,02%. Nuôi trong tủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC trong 7 ngày. Tiếp tục bổ sung 10% giống sau khi nuôi cấy 7 ngày vào môi trường Sabouraud, nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC trong vòng 36 giờ. Lúc này chủng nấm đã được hoạt hóa sẵn sàng để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.1.4. Phương pháp tuy n chọn chủng nấm sinh cyclooligomer depsipeptide

Các chủng nấm sau khi được hoạt hóa sẽ được nuôi cấy trong môi trường Sabouraud, nuôi trong tủ lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt độ 25oC trong 6 ngày. Tiến hành thu sinh khối và dịch nuôi cấy và phân tích hàm lượng COD trong tế bào. Các chủng được tuyển chọn là chủng có tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng sinh tổng hợp COD cao.

2.2.1.5. Phương pháp đông khô

Tiến hành nuôi cấy chủng nấm trên môi trường Sabouraud lỏng trong tủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC. Tiến hành li tâm thu sinh khối, sau đó rửa với nước cất giữ lại sinh khối tế bào, đông khô bằng máy đông khô Flexi Dry (Mỹ), sau đó dùng để phân tích hàm lượng COD trong tế bào.

2.2.1.6. Phương pháp lựa chọn môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh trưởng và tích lũy COD của chủng tuy n chọn

- Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp COD

Chủng nấm đã được hoạt hóa 36 giờ trong môi trường Sabouraud, ở 25oC, lắc 150 vòng/phút được bổ sung (5% v/v) vào các bình tam giác 1,0 lít chứa 600 ml môi trường dịch chiết khoai tây (PBG); môi trường Sabouraud (SBR); môi trường khoáng tối thiểu (MM); môi trường Czapek-Dox (CzD); môi trường xác định fusarium (FDM). Nấm được nuôi trong điều kiện lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 25oC trong vòng 12 ngày. Lượng sinh khối tế bào và COD được xác định mỗi ngày, bước nhảy 24 giờ.

- Ảnh hưởng của độ pH môi trường

Dựa trên môi trường đã chọn, tiến hành xác định ảnh hưởng của pH dựa vào nguồn Cacbon và Nitơ đã lựa chọn bằng cách bổ sung 5 % chủng vi nấm đã hoạt hóa 36 giờ vào trong bình tam giác chứa 25ml các môi trường có độ pH 3 - 8 với bước nhảy 0,5. Nuôi trong tủ lắc và lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 250C trong 6 ngày. Thu mẫu xác định CDW và hàm lượng COD tạo ra.

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Dựa trên môi trường và độ pH đã lựa chọn, tiến hành bổ sung 5% chủng vi nấm đã hoạt hóa 36 giờ vào trong bình tam giác định mức 100ml chứa 25ml môi trường thu sinh khối với các nguồn cacbon khác nhau: Fructose, saccharose, glucose, lactose, tinh bột tan, galactose, mannitol. Nuôi trong tủ lắc và lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 250C trong 6 ngày.