Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam

2.5.1. Xác định hoạt độ các enzym 40

2.5.2. Xác định hàm lượng protein 43

2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu 43

2.5.4. Xác định hàm lượng cellulose 44

2.5.5. Xác định hàm lượng lignin 44

2.5.6. Phương pháp xác định lượng đường trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) 46

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 47

3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn 51

3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa 51

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 138 trang tài liệu này.

3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối 54

3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4 56

3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase 56

3.3.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase 56

3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase 57

3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase .. 59

3.3.3. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế phẩm 62

3.3.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 62

3.3.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4 63

3.3.4. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose. 66

3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1 67

3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1

.................................................................................................................................. 67

3.4.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase 67

3.4.1.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật nuôi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn MP1 68

3.4.2. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase 70

3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ 70

3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon 71

3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae 71

3.4.2. Xác đl "_Toc77151043" ợng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusaeC 72

3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol 72

3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 73

3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 75

3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của chủng C. cellulans MP1 76

3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1 76

3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1 77

3.5.3. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate 78

3.5.4. Khai thác các enzyme thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C. cellulans MP1 80

3.6. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1 83

3.6.1. Xác định thành phần nguyên liệu rơm 83

3.6.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân 83

3.6.3. Ảnh hưởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym 84

KẾT LUẬN 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 99

PHỤ LỤC .......................................................................................................... 90100

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc tính enzym cellulase và Xylanase từ C.cellulans 11

Bảng 1.2 Tính bền nhiệt của cellulase và xylanase từ C.cellulans. 12

Bảng 1.3 Tính bền pH của cellulose và xylanase từ C.cellulans. 12

Bảng 1.4. Tổng kết một số loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase đã được phân lập từ ruột các loài mối 18

Bảng 2.1. Thông tin các mẫu mối 28

Bảng 2.2. Giá trị mã hóa và thực nghiệm Design-Expert 7.1 34

Bảng 3.1. Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối 47

Bảng 3.2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các môi trường làm giàu

.................................................................................................................................. 48

Bảng 3.3 Các chủng có tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa 49

Bảng 3.4 Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn 50

Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn 52

Bảng 3.6 Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối 54

Bảng 3.7 Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm 60

Bảng 3.8 Kết tủa cellulase bằng ammonium sulfate bão hòa 62

Bảng 3.9 Kết tủa cellulase bằng acetone 63

Bảng 3.10 Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4 66

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym 68

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng N tới khả năng sinh enzym của chủng MP1 70

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon tới khả năng sinh enzym chủng MP1 71

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của chủng MP1 71

Bảng 3.15 Kết tủa enzym thô sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ khác nhau

..................................................................................

Bảng 3.16. So sánh giữa enzym từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 75

Bảng 3.17 Danh mục các cellulase và hemicellulase dự đoán biểu hiện trên genome of C. cellulans MP1 81

Bảng 3.18 Một số thành phần hóa học của rơm trước và sau tiền xử lý bằng kiềm(% chất khô nguyên liệu) 83

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất đường hóa 84

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất đường hóa 84

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hóa 85

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/lỏng tới hiệu suất đường hóa 85

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ enzym tới hiệu suất đường hóa 86

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất đường hóa 86

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2] 5

Hình 1.2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] 6

Hình 1.3. Hệ vi sinh vật trong ruột mối [39] 16

Hình 1.4 Phân bố các họ vi khuẩn trong ruột mối và côn trùng [41] 18

Hình 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose [9] 20

Hình 1.6.Cấu trúc hóa học phân tử cellulose [9] 20

Hình 1.7 Công thức hóa học của hemicellulose [29] 21

Hình 1.8 Các đơn phân của lignin 21

Hình 1.9 Hoạt động của các enzym hemicellulose [51] 22

Hình 1.10 Hoạt động của các enzym cellulose [51]] 23

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu trong luận án 30

Hình 2.2 Các bước phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối [25] 32

Hình 3.1. Hình ảnh mẫu mối thu thập 47

Hình 3.2 Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối 51

Hình 3.3 Hoạt độ CMCase của chủng B. subtlis G4 trên các môi trường nuôi cấy. 56 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các thông số nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của B. subtilis G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ (C) và pH môi trường (D). 57

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp CMCase từ vi

khuẩn G4 58

Hình 3.6 . Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu tương lên hoạt độ CMCase của B. subtilis G4 59

Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ Bacillus G4 cho thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu tương và casein 61

Hình 3.8 Zymogram (A) và vòng thủy phân (B) trên môi trường cám (1) và môi trường tinh bột (3) 62

Hình 3.9. Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên môi trườngtrước và sau tối ưu 62

Hình 3.10 Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4 64

Hình 3.11 Độ bền của enzym bởi nhiệt độ 64

Hình 3.12. pH tối ưu cho hoạt dộ CMCase của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4

……. ......................................................................................................................... 65

Hình 3.13. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ Bacillus G4 65

Hình 3.14: Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC 67

Hình 3.15 Ảnh hưởng các thông số kỹ thuật tới sinh tổng hợp enzym từ MP1 69

Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của Cellulosimicrobium sp MP1 70

Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1 73

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1 74

Hình 3.19. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1 74

Hình 3.20. Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1 75

Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4 76

Hình 3.22 Sơ đồ genom của C.cellulans MP1 77

Hình 3.23 Phân loại chức năng gen 78

Hình 3.25 So sánh genom của MP1 với các chủng C.cellulans 80

Hình 3.26. Sản phẩm thủy phân rơm sử dụng cellulase từ MP1 bằng HPLC 87

MỞ ĐẦU

Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người. Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn.

Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose.

Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác. Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau.

Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu.

Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam”

Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối.

Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam

- Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được

1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam

2. Nội dung nghiên cứu

(1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối

(2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối

(3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn

(4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm

(5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn

(6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học

(1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam.

(2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối

(3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng.

(4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm

Ý nghĩa thực tiễn

(1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối

(2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này.

Đóng góp mới của đề tài

- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối.

- Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose