Thí Nghiệm 2: Ảnh Hưởng Của Vi Khuẩn E. Ictaluri Lên Một Số Chỉ Tiêu Huyết

không cho ăn 2 ngày trước khi thí nghiệm để tránh phân cá làm ảnh hưởng đến thí nghiệm. Nước được cho vào bể nhựa lót nilon 60L chứa 50L nước và sục khí liên tục trong 1-2 ngày để khử chlor trước khi thí nghiệm.

Trong thời gian thí nghiệm, bể được sục khí nhẹ nhằm đảm bảo đủ oxy cho cá. Cá chết được ghi nhận vào các khoảng thời gian sau thí nghiệm như 6, 9, 12, 24, 48 và 96 giờ. Khi xuất hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng nước.

Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cao nhất gây chết không quá 10% cá sau 96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá sau 1-2 giờ. Khoảng nồng độ này cơ sở cho bố trí thí nghiệm xác định LC50.

Bước 2: Thí nghiệm xác định giá trị LC50

Thí nghiệm này được dựa vào kết quả của thí nghiệm xác định khỏang gây chết. Trong giới hạn nồng độ thuốc gây chết sẽ được chia thành 6 mức nồng độ và 1 đối chứng. Các nghiệm thức được bố trì hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại cho mỗi nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí trong bể kính hình chữ nhật chứa 50 L dung dịch. Mỗi bể thả 10 cá, cá được thả vào bể 2-3 ngày trước khi cho thuốc vào. Trước khi cho thuốc cần vệ sinh sạch bể, trong thời gian thí nghiệm các bể được sục khí nhẹ và liên tục và không thay nước.

Theo dòi và ghi nhận số cá chết sau 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ sau thí nghiệm. Khi phát hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn chế ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.

Giá trị LC50 được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971).

3.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri lên một số chỉ tiêu huyết học của cá tra giống

Thí nghiệm xác định LD50 : thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể. Cá thí nghiệm được tiêm (0,1ml vi khuẩn/cá) tại gốc vi ngực. mật độ vi khuẩn E. ictaluri tiêm cho cá thí nghiệm được trình bày như sau :

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dòi liên tục trong 14 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẩu quan sát dấu hiệu bệnh mủ gan và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận tỳ tạng. Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định theo công thức của Reed and Muench (1938) :

LogLD50= LogA +(50%-d%)/(%t-%d)xLog10

Trong đó : LogA : nồng độ nhỏ và cận 50% Log 10 : độ pha loãng

%d : % số cá chết nhỏ và cận 50%

%t : % số cá chết lớn và cận 50%

Chuẩn bị thí nghiệm : cá thí nghiệm (trọng lượng từ 20-25g) được nuôi dưỡng trong bể có thể tích 1m3, có sụ khí và cho ăn hằng ngày theo nhu cầu. Trước khi thí nghiệm cá được lựa chọn là những cá khỏe, nước và dụng cụ thí nghiệm được khử trùng, bằng chlorine.

Bố trí thí nghiệm: gồm 3 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Bố trí 25con/bể và các nghiệm thức gồm:

NT1: Nghiệm thức đối chứng (cá được tiêm với nước muối sinh lý).

NT2: Nghiệm thức cá được tiêm với vi khuẩn E. ictaluri với nồng độ LD50. NT3: Nghiệm thức cá được tiêm với vi khuẩn E. ictaluri với nồng độ 10% LD50.

3.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Cypermerthrin lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu huyết học của cá tra giống

Bố trí thí nghiệm: gồm 3 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Bể đối chứng chứa cá không gây cảm nhiễm thuốc. Chọn cá đồng cỡ và không cho ăn một ngày trước khi bố trí thí nghiệm. Cá được cân trọng lượng và đo chiều dài trước khi thả vào bể thí nghiệm. Trong thời gian 14 ngày thí nghiệm cá không cho ăn. Bố trí 40 con/bể (100lít) và các nghiệm thức thí nghiệm gồm:

NT1: Nghiệm thức đối chứng

NT2: cá được nuôi trong bể có hóa chất Cypermerthrin với nồng độ 50% LC50. NT3: cá được nuôi trong bể có hóa chất Cypermerthrin với nồng độ 10% LC50.

3.3 Phương pháp thu mẫu

3.3.1 Thời gian thu mẫu Thu mẫu cá nhiễm vi khuẩn Theo dòi bệnh lý của cá

Thu mẫu cá lờ đờ và cá chết sau đó cân trọng lượng, đo chiều dài từng con. Thu máu để phân tích huyết học và các chỉ tiêu khác.

- Lấy mẫu cá sau 0, 3,6, 12, 24, 48, 96 giờ.

- Vớt những cá có dấu hiệu lờ đờ hoặc gần chết.

Thu mẫu cá nhiễm hóa chất

Quan sát và ghi nhận những dấu hiệu cũng như biểu hiện của cá, theo dòi tỉ lệ chết của cá trong suốt quá trình thí nghiệm.

- Lấy mẫu cá sau 0, 3, 6, 12, 24, 48, 96 giờ.

- Thu mẫu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học trên những mẫu cá có dấu hiệu lờ đờ, gần chết.

3.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học Hồng cầu

Cho máu vào ống eppendorf và tiến hành nhuộm mẫu theo phương pháp Natt và Herrick (1952). Cho 10µl máu vào ống nghiệm có chứa 1990 µl dung dịch natt và Herrick lắc nhẹ. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ hồng cầu bằng cách chọn 5 vùng đếm lặp lại 2 lần. Mật độ hồng cầu tính theo công thức:

HC = C x 10 x 200 (tb/mm3) (Trong đó C: Tổng tế bào hồng cầu ở 5 vùng đếm)

Bạch cầu

Dùng ống tiêm 1ml máu ở mạch máu phần đuôi cá. Cho 1 giọt máu lên lame và trãi đều mẫu, để khô tự nhiên trong không khí. Cố định mẫu bằng methanol. Tiến hành nhuộm mẫu theo phương pháp Humason (1979). Cho lame mẫu vào dung dịch Wright trong 3-5 phút. Chuyển sang dung dịch pH 6.2-6.8 từ 5-6 phút. Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút. Tiếp tục cho mẫu vào dung dịch pH 6.2 từ 15-30 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất, để khô tự nhiên. Đọc kết quả dưới kính hiển vi.

Phương pháp đo Hematorite

Theo Larsen và Snieszko (1961) (Trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)

Phương pháp so màu quang phổ

Theo Oser (1965) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)

Số lượng huyết sắc tố mmol/l (A) = (0,019 + 37,74 a) × 0,621

Trong đó: a là mức độ hấp thu ánh sáng hay số đo được từ máy so màu quang phổ

Số lượng huyết sắc tố g/100ml = A × 1,6125

Các chỉ tiêu huyết học tính tóan theo phương pháp của Weinberg và ctv (1972) (tríchdẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998)

Thể tích hồng cầu (MCV: mean cell volume):

Tỷ lệ huyết cầu (%)

MCV ((µm3)= x 10

Số lượng hồng cầu (106/mm3)

Khối lượng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH : mean cell hemoglobin):

Huyết sắc tố (g/dL)

MCH (pg) = x 10

Số lượng hồng cầu (106/mm3)

Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC : mean cell hemoglobin concentration):

MCHC (%) =

Huyết sắc tố (g/dL) x 100

Tỷ lệ huyết cầu (%)

3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phân tích phương sai ANOVA một chiều để tìm ra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức với mức ý nghĩa p<0,05. Sử dụng phần mềm Excel và SPSS 16.0 để xử lý thống kê.

CHƯƠNG 4:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Giá trị LC50 của thuốc trừ sâu Cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin lên cá tra

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nước tĩnh, các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm được trình bày trong Bảng 1. Cho thấy nhiệt độ buổi chiều cao hơn buổi sáng từ 0,2-0,4oC. pH khá ổn định trong thời gian thí nghiệm 7,12 đến 7,34. Hàm lượng oxi hòa tan nằm trong khoảng 4,69 mg/L ở các nghiệm thức. Hàm lượng oxi hòa tan từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến thời điểm cuối thí nghiệm có sự chênh lệch lớn là do suốt quá trình thí nghiệm các bể tiến hành trong điều kiện hoàn toàn không sục khí, cá sử dụng oxi trong quá trình hô

hấp làm giảm dần lượng oxi hòa tan trong nước. Tuy nhiên lượng oxi gần như đồng đều giữa các nghiệm thức ở từng thời điểm

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể trước khi tiến hành thí nghiệm

Chỉ tiêu

Sáng	Chiều
pH	7,12±0,10	7,34±0,25
Oxy hòa tan	5,02±0,07	4,69±0,09
Nhiệt Độ	27,2±0,2	27,4±0,7

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 73 trang tài liệu này.

Giá trị: trung bình ± độ lệch chuẩn.

Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm khá đồng đều và ổn định giữa các nghiệm thức thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá. Khi cho thuốc trừ sâu cyrus 25EC vào bể cá thí nghiệm, cá bắt đầu chết nhiều trong 3-9 giờ và số cá chết tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc thí nghiệm từ 0 (đối chứng) đến nồng độ cao nhất là 0,3 mg/L, cá tăng hoạt động hô hấp và giảm hoạt động bơi lội, thời gian hoạt động bơi lội giảm khi nồng độ thuốc gia tăng. Ở nồng độ thuốc cao khi tiếp xúc thuốc sau 1 giờ mang cử động mạnh để tăng cường hô hấp, cá biểu hiện mất thăng bằng, bơi lội không định hướng, giảm bơi lội, sau đó cá chết. Tỷ lệ chết gia tăng theo sự gia tăng nồng độ.

Kết quả thí nghiệm cho thấy giá trị LC50-96h của cypermethrin đối với cá tra khá cao. Giá trị LC50-96 giờ của cypermethrin đối với cá tra của thí nghiệm này là 0,072 mg/L. Một số nghiên cứu khác với hoạt chất cypermethrin cho thấy giá trị LC50-96 giờ trên cá giống Labeo rohita được tìm thấy ở nồng độ 0,139 mg/L (Basanta, 2002), giá trị LC50-24h của họat chất cypermethrin trên cá Cyprinus

carpio là 1,86 ppm (Suvetha, 2010). Tuỳ loại hoạt chất, loài cá khác nhau mà giá trị LC50 khác nhau. Độc tính của thuốc trừ sâu còn tuỳ thuộc vào kích cỡ cá, cá nhỏ chịu đựng kém hơn cá lớn là do hàm lượng lipid trong cơ thể cá lớn cao nên dự trữ được nhiều độc chất hơn (Murty, 1988). Cá hoạt động mạnh sau khi tiếp xúc với cypermethrin làm tăng quá trình trao đổi chất dẫn đến tăng hấp thu chất độc trong cơ thể. Sự tổn thương trê thận cá theo Farombi et al. (2008) thí nghiệm Butachlor trên cá Clarias gariepinus thì sự giảm hoạt tính men GST ở thận liên quan đến sự dư thừa chất bất hoạt enzyme, chất này tạo liên kết cystine (cysteina β-lyase hoặc chất nền chứa O-) từ chất chuyển hóa glutathion (GSH) và gây độc trên thận. Tuy nhiên, Koesoemadinata và Djajadirecdja (1976) cho rằng

độc tính của thuốc BVTV có giá trị LC50<1 mg/L nằm trong nhóm thuốc BVTV có độc tính cao. Giá trị LC50-96 giờ là 0,072mg/L thì cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin có độc tính rất cao đối với cá tra giống. Theo Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư (2010) thì các chất độc xuất hiện trong môi trường nước có thể làm tổn thương các tế bào biểu bì mang, làm đông đặc chất nhầy tạo thành một màng bao bọc bề mặt hô hấp, ngăn cản quá trình trao đổi khí giữa cá và nước và cá sẽ chết ngạt. Ngoài ra, các chất độc cũng có thể làm tổn thương cơ quan hô hấp phụ như da, cơ quan trên mang và ruột.

4.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrus chứa hoạt chất cypermethrin lên chỉ tiêu huyết học

4.2.1 Số lượng hồng cầu

Bảng 4.1. Số lượng hồng cầu (106 tế bào/mm3) của cá trong quá trình thí nghiệm với cypermethrin

Thời Gian Thu Mẫu

	Nghiệm thức
		0,036 mg/L	0,072 mg/L
	Đối chứng	(cypermethrin)	(cypermethrin)
0h	2,22±0,15a	2,07±0,14a	2,15±0,11a
3h	1,90±0,05a	1,45±0,11b	1,54±0,03b
6h	1,86±0,13ab	1,94±0,11a	1,53±0,05b
9h	1,96±0,05a	2,07±0,06a	1,77±0,07ab
12h	2,09±0,07a	1,78±0,03b	1,47±0,04c
24h	1,93±0,11a	1,99±0,07a	1,35±0,05c
48h	1,82±0,02a	1,44±0,01bc	1,47±0,06bc
72h	1,90±0,19a	1,71±0,13ab	1,57±0,02b
96h	1,99±0,09a	1,78±0,05ab	1,69±0,04ab

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng hồng cầu của cá tra có xu hướng giảm so với đối chứng sau khi tiếp xúc với cypermethrin. Sau 3h cá tiếp xúc thuốc tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức đều giảm so với đối chứng, ở nồng độ 0,072 mg/L giảm từ 2,15 triệu tế bào/mm3 xuống 1,54 triệu tế bào/mm3 (giảm 28,37%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,073 triệu tế bào/mm3 xuống 1,453 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,90%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

Số lượng hồng cầu ở nghiệm thức 0,072 mg/L và 0,036 mg/L cho thấy sau khi cá tiếp xúc thuốc cyrus có xu hướng tăng nhẹ ở 6h và 9h nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng. Ở thời điểm 12h sau khi cá tiếp xúc thuốc số lượng Hồng cầu cả 2 nghiệm thức giảm so với đối chứng, ở nồng độ thuốc 0,072 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,473 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,52%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,783 triệu tế bào/mm3 (giảm 14,68%), khác biệt có ý nghĩa (p<0,05). Nghiệm thức 0,072 mg/L cho ta thấy số lượng hồng cầu giảm khác biệt có ý nghĩa ở các thời điểm so với đối chứng (p<0,05). Hiện tượng giảm tế bào hồng cầu có khả năng do cypermethrin làm ức chế cơ quan tạo và tổng hợp hồng cầu, gia tăng phá hủy hồng cầu trong cơ quan tạo máu. Đến 96 giờ cả hai nghiệm thức ở nồng độ 0,072 mg/L và 0,036 mg/L tổng lượng hồng cầu tăng nhẹ nhưng vẫn thấp hơn và không khác biệt so với đối chứng.

Kết quả này cũng tương tự như một số nghiên cứu khác cùng hoạt chất cypermethrin trên cá rohita số lượng hồng cầu giảm có ý nghĩa so với đối chứng ở nồng độ thuốc 0,16µg/L, 0,4µg/L và 0,8 µg/L sau khi tiếp xúc thuốc trong suốt quá trình thí nghiệm (Adhikari et al. , 2004). Sự thay đổi tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức cá rohita nhiễm cypermethrin trong 45 ngày cho thấy giảm so với đối chứng nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) (Das, 2003).

Tuy nhiên theo Hii và ctv (2007) nghiên cứu trên lươn đồng khi tiếp xúc với endosulfan hồng cầu tăng sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, nhưng thời điểm 96 giờ hồng cầu lại giảm so với đối chứng. Sau khi tiếp xúc với diazinon (2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L, 16 mg/L, 32 mg/L) số lượng hồng cầu giảm thấp và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trên cá da trơn giống (Koprucu et al, 2006). Khi cá tiếp xúc với thuốc diazinon thì mang của cá sẽ bị hoại tử hay lớp màng nhầy của mang bị cô đặc lại làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của cá, cá sẽ phản ứng lại thông qua gia tăng số lượng hồng

cầu bằng cách huy động lượng máu từ kho dự trữ hoặc tăng nhanh quá trình tạo máu (Đỗ Thị Thanh Hương, 2010).

Cá tiếp xúc với nồng độ thuốc cao, thuốc thâm nhập vào máu hồng cầu bị phá vỡ làm cho số lượng hồng cầu trong cơ thể giảm thấp và có hiện tượng nhân hồng cầu phân thùy hay phân hủy cũng xuất hiện trên lame. Những biểu hiện bất thường ở hồng cầu như trên cũng được Vosyliene & Svecevìeius (1997) mô tả như là biểu hiện bệnh lý của cá nhiễm độc kim loại. Tế bào hồng cầu được tạo ra từ mô của tụy hoặc tì tạng, khi cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ cao cơ quan tạo hồng cầu bị phá vỡ ảnh hưởng đến quá trình tạo hồng cầu trong máu (Morgan et al., 1980 trích dẫn Koprucu et al., 2006).

4.2.2 Số lượng bạch cầu

Bảng 4.2: Số lượng bạch cầu (104 tế bào/mm3) trong quá trình thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin

Thời Gian Thu Mẫu

	Nghiệm thức
		0,036 mg/L	0,072 mg/L
	Đối chứng	(cypermethrin)	(cypermethrin)
0h	18,40±1,43a	18,23±1,65a	17,64±1,02a
3h	15,32±0,33a	12,40±0,95b	12,30±0,90b
6h	14,57±2,22a	11,56±0,77b	11,06±1,04b
9h	15,47±0,93a	12,73±1,34b	12,58±0,53ab
12h	15,26±1,49a	15,04±0,42a	11,19±0,44b
24h	15,37±1,44a	13,72±0,30b	11,27±0,43bc
48h	14,32±1,44a	11,74±0,08b	12,83±1,00ab
72h	14,37±0,52a	13,43±0,38ab	12,00±0,67ab
96h	13,87±1,37ab	13,52±0,60a	12,83±0,37ab

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

Sau 3 giờ, bạch cầu của cá ở nghiệm thức đều bị giảm, nghiệm thức ở nồng độ 0,072 mg/L giảm từ 18,23 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,40 nghìn tế bào/mm3 (giảm 31,98%) và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 mg/L giảm từ 17,64 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,30 nghìn tế bào/mm3 (giảm 30,27%) đồng thời cũng giảm khác biệt có ý nghĩa so với số lượng bạch cầu của cá ở lô đối chứng. Cá tiếp xúc thuốc Cyrus sau 6h tổng lượng bạch cầu vẫn giảm so với ban đầu và so với đối chứng, nghiệm thức cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ 0,072 mg/L giảm 20,65% và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 giảm 24,09% so với đối chứng tại cùng thời điểm 6 giờ. Sau 12 và 24 giờ số lượng bạch cầu của cá ở nghiệm thức 0,072 mg/L vẫn còn giảm và sai khác có ý nghĩa. Sau 96 giờ lượng bạch cầu ở 2 nồng độ 0,072