Biến Tính Pns Bằng Gelatin (Tổng Hợp Pns-Aptes-Cooh-Ge Là Chất Mang 4) Tổng Hợp

Hình 1.18. Phản ứng tổng hợp mPEG-p-nitrophenyl carbonate

Tổng hợp Chitosan-mPEG

Trong phản ứng này, do chitosan có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải dùng dư chitosan so với dự kiến để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.

Phương trình phản ứng:

Hình 1.19. Phản ứng tổng hợp chitosan-mPEG Tạo liên kết giữa PNS-GPTMS và CS-mPEG

Phản ứng của chitosan lên bề mặt của nano silica vừa biến tính hoàn toàn có thể tạo ra nhờ khả năng hoạt động mạnh của vòng epoxy trong pH cao lẫn pH thấp. Tuy nhiên để chọn lựa pH như thế nào để CS-mPEG vẫn còn giữ được liên kết amide của mình sau phản ứng là vấn đề đáng chú ý.

Trong nghiên cứu này, pH khoảng 3 đến 4 được lựa chọn, vì ở pH này liên kết amide này không bị thủy phân.

Hình 1.20. Phản ứng biến tính nano silica bởi Chitosan-mPEG.

1.6.2.3. Biến tính PNS bằng Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4) Tổng hợp PNS-APTES- AnhydrideSuccinic

Nhằm để biến tính hiệu quả hạt silica, luận án tiến hành gắn nhóm COOH lên bề mặt hạt nano PNS-APTES bằng cách cho PNS-APTES phản ứng với anhydride succinic trong dung môi aceton

Hình 1.21. Phản ứng tạo gắn anhidride succinic lên PNS (PNS-APTES-COOH)

Khi cho bề mặt của hạt silica có nhóm amino phản ứng với anhydride succinic trong điều kiện lạnh và pH khoảng 6–7 và dung môi DMF. Phản ứng diễn ra theo cơ chế mở vòng anhydride succinic. Đầu tiên, đôi điện tử của nhóm amino sẽ tác kích vào nhóm carbonyl, tiếp theo là sự di chuyển proton từ nitrogen đến oxygen của vòng tạo ra liên kết của amino và hình thành nhóm -COOH bên ngoài bề mặt hạt.

Tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE

Để quá trình biến tính đạt hiệu suất cao cho quá phản ứng biến tính nano silica cần hoạt hóa nhóm -COOH của PNS-APTES-COOH trước bằng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC):

Hình 1.22. Phản ứng hoạt hóa PNS-APTES-succinic bằng EDC.

Sau khi tiến hành hoạt hóa sẽ thực hiện quá trình biến tính PNS-APTES-succinic với gelatin. Quá trình tạo liên kết PNS-APTES-Succinic với gelatin theo phản ứng sau:

Hình 1.23. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với gelatin

1.6.2.4. Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay còn gọi là PNS-APTES-GEL-mPEG là chất mang 5)

Tổng hợp Gelatin-mPEG

Nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thông trong cơ thể, nghiên cứu này tiến hành gắn mPEG cho Gelatin trước khi biến tính lên bề mặt silica. Để tổng hợp được nano Gelatin-mPEG ta tiến hành 2 bước:

Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)

Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C như phản ứng hình 2.6.

Phản ứng xảy ra theo cơ chế tương tự như phản ứng ester hóa. Trong cấu trúc của NPC, liên kết CO có tính chất không no và bị phân cực mạnh về phía oxygen, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử.

Trong khi đó trên nguyên tử oxygen của nhóm OH của phân tử mPEG còn hai đôi điện tử tự do, nên nguyên tử oxygen đóng vai trò như một tác nhân ái nhân (thân hạch). Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC

Điều đáng chú ý là tác chất NPC và sản phẩm mPEG-NPC có hoạt tính rất mạnh, dễ bị thủy phân trong môi trường nước, do đó để đạt được hiệu suất phản ứng cao thì phản ứng phải được thực hiện trong điều kiện khan nước, ở nhiệt độ thấp, trong môi trường khí nitrogen; tác chất và dung môi phải được làm khan trước khi tiến hành phản ứng. Để hạn chế sự thủy phân sản phẩm tạo thành, sản phẩm thu được phải được sấy khô trong tủ sấy chân không, bảo quản trong bình hút ẩm tránh ánh sáng và hơi ẩm trong không khí.

Phản ứng gắn gelatin với mPEG

Ban đầu mPEG được cho tác dụng với NPC để thu được mPEG-NPC. Tác chất này sau đó phản ứng với Gelatin để thu được sản phẩm Gelatin-mPEG.

Trong phản ứng này, do Gelatin có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải pha loãng Gelatin để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.

Phương trình phản ứng:

Hình 1.24. Phản ứng tổng hợp gelatin-mPEG.

Tổng hợp PNS-APTES-Succinic-Ge-mPEG

Sau khi tiến hành hoạt hóa PNS-APTES- Anhydride succinic bằng EDC (hình 2.10), ta sẽ thực hiện phản ứng của PNS-APTES- Anhydride succinic với Gelatin-mPEG.

Hình 1.25. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với Gelatin-mPEG

Sau khi quá trình tổng hợp hoàn thành, sản phẩm thu được sẽ là vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (có thể gọi tắt là PNS-GEL-mPEG). Vật liệu này được tổng hợp với kích thước mong muốn là 20 nm < d < 100 nm, trong đó d là đường kính hạt. Ngoài ra vật liệu được tổng hợp sẽ có cấu trúc dạng tổ ong nên sẽ có nhiều lỗ xốp, nhờ vậy khi thực hiện quá trình mang thuốc các hạt thuốc sẽ có thể được hấp phụ trên bề mặt vật liệu trong các lỗ xốp.

1.6.2.5. Biến tính PNS bằng SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG hay còn gọi PNS@CS- PEG là chất mang 6)

Gắn cầu nối disulfide, hình thành PNS-SS-COOH

Đầu tiên hạt nano silica xốp có kích thước thích hợp được biến tính lần lượt với tác nhân 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) để thu được PNS-APTES. Tiếp theo, PNS-APTES phản ứng với 3,3’-dithiodipropionic acid PNS-SS-COOH dưới dạng hạt nano.

Hình 1.26. Phản ứng tạo PNS-SS-COOH

Tổng hợp PNS@CS-PEG (PNS-APTES-CS-PEG)

Các bước tổng hợp được thể hiện trong như sau: Bước 1: PNS-SS-COOH được hoạt hóa với EDC

Hình 1.27. Phản ứng hoạt hóa PNS-SS-COOH với EDC

Bước 2: PNS-SS-COOH sau khi hoạt hóa với EDC được phản ứng với CS-PEG

Hình 1.28. Phản ứng tổng hợp chất mang thuốc PNS@CS-PEG

1.7. Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity test)

An toàn dược phẩm là yếu tố cực kỳ quan trọng. Việc thử nghiệm độc tính tế bào là bước đầu không thể thiếu đối với việc nghiên cứu 1 loại vật liệu dẫn truyền thuốc[32, 52, 53].

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất và thiết bị

2.1.1. Hóa chất

Bảng 2.1. Tên hóa chất và nơi xuất xứ

Tên hóa chất

Xuất xứ
Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB)	Merck
1-Ethyl-3-(3-dimethylami nopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Merck
Gelatin Chitosan	Merck
Acid acetic	Trung Quốc
Succinic anhydride	Merck
Diethyl ether	Merck
(3-aminopropyl)triethoxy silane (APTES) 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane	Merck
Ethanol	Tây Ban Nha
Tetrahydrofuran	Merck
Màng cellulose 6000-8000 và 3000-5000 Da	Merck
Dithiodipropionic acid (DTDP)	Merck
4-Nitrophenyl chloromate	Merck
Doxorubicin (DOX) Fluorouracile (5-FU) Sodium hydroxide Acid clohydric	Merck Merck Trung Quốc Trung Quốc

 Máy cô quay Strike 300
 Máy khuấy từ gia nhiệt	 Cân điện tử EB35B-Pro
 Tủ sấy KETDNG 101	 Máy tạo khí N2
 Máy li tâm	 Máy đo pH AB15
 Bình tam giác, cốc thủy tinh	 Phễu lọc, bình cầu
 Phễu chiết, ống đong  Máy đo UV-vis	 Giấy đo pH, giấy lọc.