Quy Trình Khảo Sát Hoạt Tính Gây Độc Bằng Phương Pháp Srb

2.2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (NCI H460), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (Hep G2) và ung thư máu (Jurkat) do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường E’MEM (MCF-7, NCI H460, HeLa và Hep G2) hoặc RPMI (Jurkat) có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 μg/mL), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 μg/mL), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2.

2.2.4.2. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB

Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa, Hep G2 và MCF-7); 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng NCIH460) và 5.104 tế bào/giếng đối với dòng tế bào Jurkat. Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh (riêng Jurkat là 70%) và nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Xử lý kết quả:

Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620):

- Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (1)

- Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb – ODblank (2)

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 137 trang tài liệu này.

- Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức: Với: %I = (I - ODTN / ODC ) x 100%

- ODtb : giá trị OD của giếng có chứa tế bào

- ODblank : giá trị OD của giếng (không có chứa tế bào)

- ODTN : giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)

- ODC : giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)

IC50 được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi qui không tuyến tính đa thông số và R2 > 0,9.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Đặc trưng của vật liệunano silica xốp (PNS)

3.1.1. Khảo sát kích thước hạt PNS bằng phương pháp solgel

Kích thước hạt đóng vai trò quan trọng đối hệ dẫn truyền thuốc. Sau khi được tiêm vào tĩnh mạch, các hạt chất mang kích thước nhỏ (10 – 20 nm) hầu hết bị bài tiết thông qua thận, trong khi các hạt lớn hơn (≥ 200 nm) bị thu hút bởi hệ thống lưới nội mô (RES). Chỉ có các hạt nano có kích thước dao động trong khoảng 20 – 100 nm là có khả năng đi qua các mao quản cực nhỏ và không bị thu hút hoặc chọn lọc bởi hệ thống lưới nội mô, kết quả là thời gian tồn tại của hệ mang thuốc trong hệ thống tuần hoàn được kéo dài và hiệu quả của thuốc hướng đích được nâng cao [59].

Theo Bogush và các cộng sự [60, 61], năm thông số quan trọng ảnh hưởng đến sự phân bố kích thước hạt là: (i) hàm lượng tetraethyl orthosilicate (TEOs), (ii) ethanol, (iii) ammoniac, (iv) nước và (v) nhiệt độ.

Để tạo ra những hạt nano silica xốp có kích thước mong muốn phù hợp với mục tiêu mang thuốc, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng TEOs, ammoniac và ethanol. Cetyltrimethylamonium bromide (CTAB) là chất hoạt động bề mặt dùng để tạo hình lỗ xốp được giữ cố định là 2,6 (g) trong tất cả các thí nghiệm.

(i) Hàm lượng TEOs:

Theo Stober và cộng sự [62] cho rằng không có sự ảnh hưởng của TEOs lên kích thước

hạt.

Bogush và công sự [63] cho thấy kích thước hạt tăng khi tăng lượng TEOs.

Helden và cộng sự [64] chứng minh ngược lại, khi tăng lượng TEOs thì kích thước

giảm.

Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành khảo sát lượng TEOs, các chất còn lại ammoniac và ethanol giữ nguyên lượng không thay đổi. Kết quả là khi tăng lượng TEOs từ 6 đến 10 mL thì kích thước giảm từ 92,8 nm đến 56,6 nm. Nhưng khi tiếp tục tăng lượng TEOs từ 10 đến 14 mL thì kích thước hạt lại tăng từ 56,6 đến 153,8 nm (xem phụ lục 1 và hình 3.1)).

Giải thích:

TEOs thủy phân ngưng tụ trong môi trường nước sẽ tạo thành những hạt nano silica hình cầu bao quanh CTAB. Khi tăng lượng TEOs nhưng lượng CTAB cố định thì CTAB sẽ

chia đều ra để phù hợp với lượng TEOs làm cho hạt nhỏ đi vì lõi ít thì hạt sẽ nhỏ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng TEOs thì hạt nano mới hình thành bao quanh hạt nano trước làm cho kích thước tăng lên.

Hình 3.1. Ảnh hưởng của TEOs lên kích thước hạt

(i) Thể tích ethanol

Theo nghiên cứu của Kota Sreenivasa Rao và cộng sự [19], khi giảm nồng độ ethanol từ 8(M) xuống 4(M) thì kích thước hạt nano giảm đáng kể. Tiếp tục kế thừa nghiên cứu trên, chúng tôi khảo sát thể tích của ethanol tại NH3 2,8% và TEOs 2,8 mL. Kết quả cho thấy khi ethanol tăng kích thước hạt tăng theo, thể tích ethanol ở 5,8 mL cho kích thước hạt nhỏ nhất (xem phụ lục 1 và hình 3.2).

Hình 3.2. Ảnh hưởng của ethanole lên kích thước hạt

(ii) Nồng độ ammoniac

Phản ứng thủy phân xảy ra rất chậm, việc sử dụng ammoniac làm xúc tác cho phản ứng thủy phân và ngưng tụ TEOs trong ethanol. Theo Matsoukas và Gulari [65], kích thước tăng đạt được bởi việc tăng nồng độ ammoniac và nước. (xem phụ lục 1 và hình 3.3).

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ amoniac lên kích thước hạt

Từ kết quả khảo sát trên, để đạt được kích thước mong muốn từ 20-100 nm thì chúng tôi tiến hành phản ứng này ở 60oC, hỗn hợp gồm 64 mL nước cất và 2,6 g cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB); 11,25 mL ethanol và 550 µL NH3 (2,8%), 8 mL tetraethyl orthosilicate (TEOS) khuấy với tốc độ vòng là 300 vòng/phút.

3.1.2. Ảnh TEM của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel

Qua kết quả đo TEM, PNS được tổng hợp ra hoàn toàn có kích thước nano dao động trong khoảng 50 nm đến 60 nm. So sánh với nghiên cứu, ta thấy các hạt nano silica hình cầu có độ đồng đều cao, với cấu trúc như thế ta có thể kết luận rằng đã tổng hợp thành công nano silica kiểm soát được hình dạng hạt. Giải quyết được vấn đề vô định hình và kiểm soát kích thước cũng như hình dạng là một trong những khó khăn để đưa loại vật liệu này vào thực tế. Với kích thước đã đạt 58,93±2,42; PNS (nano silca xốp) tổng hợp từ TEOS bằng sol-gel phù hợp với khoảng kích thước của hệ nano dẫn truyền thuốc (20÷100 nm) [59].

Hình 3.4. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nanosilica xốp (PNS)

3.1.3. Kết quả phân tích ảnh SEM của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp kết tủa.

Quá trình tổng hợp nano silica từ vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa khi cho từ từ HCl vào dung dịch sodium silicate (Na2SiO3). Thực hiện với nhiều thí nghiệm thay đổi nồng độ HCl từ 1,5 N;1,0 N và 0,5 N nhận thấy kích thước hạt giảm dần theo thứ tự 30-60 nm; 25-35 nm và 10-15 nm. Đó là do với lượng sodium silicate (Na2SiO3) cố định, khi nồng độ HCl càng giảm, lượng acid dùng cho kết tủa ít lại làm cho phản ứng xảy ra chậm hơn, và hạt càng nhỏ hơn Hình 3.5.

Hình 3.5. Ảnh SEM của nano silica xốp (PNS) tổng hợp từ vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa theo nồng độ HCl 1,5 N;1,0 N và 0,5 N

So sánh ảnh SEM nano silica xốp (PNS) tổng hợp từ vỏ trấu với các nghiên cứu đã thực hiện thì thấy hạt tổng hợp được có hình cầu rõ rệt, kích thước tương đối đồng đều [55, 66, 67].

Tuy nhiên, nano silica xốp tạo được từ phương pháp sol-gel có hình dạng tròn đều và đẹp hơn nano silica xốp tạo từ phương pháp kết tủa. Do đó, chọn nano silica xốp làm từ sol- gel cho các quá trình biến tính và mang thuốc của luận án.

3.1.4. Kết quả phân tích giản đồ XRD của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa

Như chúng ta đã biết phổ nhiễu xạ tia X cung cấp nhiều thông tin quan trọng về hình dạng cũng như cấu trúc vật liệu. Để xác nhận hạt nano có cấu trúc xốp ta lần lượt tiến hành phân tích phổ XRD góc rộng với góc quét từ 10o đến 80o đối với 2 mẫu vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa.

Điều kiện ghi mẫu ống phát tia CuK với  = 1.54056 Å, điện thế 40kV, mẫu bột, tốc độ 0.005o/giây.

Ở hình (3.6 a) là nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, ta thấy tín hiệu đặc trưng của silica ở 2θ = 22o, đỉnh vẫn rất nhọn cho thấy không có sự sụp cấu trúc tinh thể của hạt. Vậy hình dạng phổ cho thấy hạt đã có cấu trúc riêng biệt không còn là dạng vô định hình [68, 69].

Ở hình (3.6 b) là mẫu vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp kết tủa, so sánh với phổ nhiễu xạ góc rộng XRD của nano silica xốp tổng hợp bằng phương pháp sol-gel cho thấy có sự tương đồng. Và so sánh với các nghiên cứu khác cũng vậy. Qua đó đã hoàn thành tổng hợp được vật liệu nano silica xốp theo cả 2 phương pháp sol-gel và kết tủa [67, 70].

Như vậy ta đã tạo được hạt nano silica với cấu trúc xốp, việc tạo ra lỗ xốp có vai trò rất quan trọng đối với khả năng mang thuốc của vật liệu [71].

Hình 3.6. So sánh giản đồ XRD của nano silica xốp tổng hợp bằng phương pháp kết tủa (a) và bằng phương pháp sol-gel (b).

3.1.5. Kết quả FT-IR của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol- gel và phương pháp kết tủa

Để xác định các nhóm chức của vật liệu ta tiến hành phân tích phổ FTIR và ta thấy các dao động ở các số sóng như sau:

FTIR của PNS tổng hợp từ phương pháp Sol-Gel[72, 73]:

- Dao động kéo dãn và uốn cong lần lượt hấp thu ở số sóng 3417 cm-1 và 1615 cm-1 đặc trưng cho nhóm –OH.

- Ba đỉnh hấp thu đặc trưng cho là 1093 cm-1, 813 cm-1 và 466 cm-1 đặc trưng cho giao động kéo giãn của Si-O-Si.

- Đỉnh hấp thu tại số sóng 813 cm-1đặc trưng cho dao động liên kết của Si-OH (nhóm silanol).

FTIR của PNS tổng hợp từ phương pháp kết tủa

- Dãy hấp thu rộng thể hiện dao động kéo dãn ở các bước sóng 3436 cm-1 và 1627 cm-1 thuộc về nhóm –OH (silanol, Si-OH) [71, 74].

- Siloxane hấp thu mạnh trong miền 1130 cm-1 – 1000 cm-1 cụ thể là 1067 cm-1.

Và đỉnh hấp thu có bước sóng ở 797 cm-1 là Si-O-Si.

Vậy qua kết quả phân tích FTIR và so sánh với các nghiên cứu [75, 76]thì bước đầu chúng tôi đã tổng hợp thành công được vật liệu nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa

Hình 3.7. So sánh phổ FT-IR của nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol- gel và bằng phương pháp kết tủa

3.1.6. Kết quả BET của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol- gel và phương pháp kết tủa

BET của PNS tổng hợp từ phương pháp Sol-Gel

Để khảo sát diện tích bề mặt cũng như đoán biết được cấu trúc vật liệu, BET là một trong những phương pháp mạnh mẽ. Từ đường hấp phụ đẳng nhiệt trên ta thấy: đường đẳng nhiệt hấp phụ này đặc trưng cho vật liệu có cấu trúc giúp ta kết luận rằng vật liệu sau biến tính vẫn có cấp trúc xốp. Hơn nữa hạt có diện tích bề mặt là 129,818 m2/g (xem phụ lục 10), so với các nghiên cứu diện tích bề mặt vật liệu không quá lớn [47].

Với diện tích bề mặt hơi nhỏ gây hạn chế cho việc mang thuốc cho nên tiến hành biến tính PNS để tăng liên kết hóa học, tăng độ hấp phụ của thuốc và chất mang. Việc biến tính có thể không làm tăng diện tích bề mặt và thể tích lỗ xốp nhưng nếu chọn tác nhân biến tính phù hợp sẽ tạo được liên kết hóa học, tăng độ hấp phụ khi mang thuốc góp phần nâng cao hiệu suất mang thuốc.

BET của PNS tổng hợp từ phương pháp kết tủa

Khảo sát diện tích bề mặt BET của vật liệu PNS tổng hợp từ phương pháp kết tủa ta có kết quả như sau: diện tích bề mặt là 117,047 m2/g, thể tích lỗ xốp là 0,137 cm3/g và đường kính lỗ xốp là 12,037 Ao . Vậy diện tích bề mặt nhỏ hơn một chút so với vật liệu PNS tổng hợp từ phương pháp sol-gel.

3.2. Biến tính nano silica xốp

3.2.1. Biến tính thông qua cầu nối GPTMS

3.2.1.1. Biến tính bằng Hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazin-chất mang thuốc 1) Kích thước hạt nano silicate biến tính bằng chụp TEM

Theo một số nghiên cứu về ứng dụng của vật liệu nano trong lĩnh vực y học báo cáo rằng hiệu quả hấp thu của tế bào giảm khi tăng kích thước hạt. Các hạt nano trong phạm vi 100- 200 nm có tiềm năng lớn để kéo dài thời gian lưu thông trong máu vì chúng đủ lớn để tránh sự hấp thu chọn lọc trong gan, nhưng đủ nhỏ để tránh bởi cơ chế lọc của lá lách. Bên cạnh đó, kích thước nhỏ (20-100 nm) cho phép các hạt nano thụ động tập trung quanh các tế bào khối u thông qua hiệu quả thẩm thấu và lưu giữ, tăng cường tích tụ nội bào và giữ các hạt nano trong vùng khối u [33].