Đánh Giá Tác Dụng Hạ Lipid Máu Dựa Trên Mô Hình Gây Tăng Cholesterol Máu Nội Sinh

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Đánh giá độc tính bán trường diễn

Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam [6] hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới [50] và OECD [45] về hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng thuốc từ Đông y, thuốc từ dược liệu. Liều tương đương lâm sàng được tính từ liều LD50 (thử nghiệm độc tính cấp) trên chuột cống trắng.

Chuột cống trắng 30 con chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con.

+ Lô 1 (lô chứng sinh học): uống nước cất 1ml/100g/ngày.

+ Lô 2 (lô trị 1): uống cao chiết liều 18 mg/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương trên người, tính theo hệ số 6).

+ Lô 3 (lô trị 2): uống cao chiết liều 54 mg/kg/ngày (liều tương đương gấp 3 lần trên người, tính theo hệ số 6).

Chuột cống trắng được uống nước hoặc cao chiết trong 90 ngày liên tục, mỗi ngày một lần vào 8-9 giờ sáng.

Các chỉ tiêu đánh giá: Kiểm tra và theo dõi các chỉ tiêu trước lúc uống cao chiết, sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống cao chiết, bao gồm:

- Tình trạng chung, thể trọng (mg) của chuột cống trắng.

- Đánh giá chức phận tạo máu: thông qua số lượng hồng cầu (RBC), thể tích trung bình hồng cầu (MCV), hàm lượng hemoglobin (HGB), hematocrit (HCT), số lượng bạch cầu (WBC), công thức bạch cầu (NEU và LYM) và số lượng tiểu cầu (PLT).

- Đánh giá chức năng gan: thông qua định lượng chất chuyển hoá trong máu: bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol.

- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan: thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: alanin aminotransferase (ALT), aspartat aminotransferase (AST).

- Đánh giá chức năng thận: thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh.

- Xét nghiệm mô học: Sau 90 ngày uống cao chiết, mổ chuột để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô. Đối với các con bị chết, cần mổ nghiên cứu các mô bệnh học. Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Thời gian thử nghiệm: độc tính bán trường diễn được thực hiện trong 90 ngày.

Thời điểm xét nghiệm: Lấy máu để làm các chỉ số xét nghiệm trên tại 4 thời điểm: trước thí nghiệm (T0), sau 30 ngày (T30), sau 60 ngày (T60) và sau 90 ngày (T90) uống thuốc.

2.2.2. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu dựa trên mô hình gây tăng cholesterol máu nội sinh

Thực hiện trong 7 ngày. Gây mô hình rối loạn lipid máu nội sinh bằng cách tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200 mg/kg (0,1 mL/10g) [39, 49, 52].

Chuẩn bị dung dịch P-407 2% bằng cách pha 0,4g P-407 trong nước muối sinh lý 0,9% vừa đủ 20 mL, để tủ lạnh qua đêm để làm tăng độ tan của P-

407. Kim và xylanh dùng để tiêm chuột được ngâm trong nước đá trước khi sử dụng. Mô hình rối loạn lipid máu gây ra Poloxamer 407 (P-407) được Millar và cộng sự (2005) mô tả trong thiết kế thí nghiệm, các động vật được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con.

- Lô 1 (lô đối chứng sinh học): Cho chuột uống nước cất 0,2mL/10g thể trọng/ngày; sau đó tiêm màng bụng 0,9% NaCl 10 mL/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 2 (lô mô hình P-407): Cho chuột uống mỗi lần nước cất 0,2mL/100g thể trọng/ngày; sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 3 (lô đối chứng dương): Chuột uống atorvastatin liều 100mg/kg/ngày; sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 4 (lô trị 1: dịch chiết lá chè vằng liều thấp): Cho chuột uống dịch chiết chè vằng với liều 36 mg/kg thể trọng/ngày (liều tương đương trên người); sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 5 (lô trị 2: dịch chiết lá chè vằng liều cao): Cho chuột uống dịch chiết lá chè vằng với liều 108 mg/kg thể trọng/ngày (liều gấp 3 lần liều tương đương trên người); sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

Chuột được uống nước cất và thuốc thử hàng ngày. Đến ngày thứ 7 chuột ở tất cả các lô (trừ lô 1) được tiêm màng bụng dung dịch P-407. Sau khi được tiêm P-407, chuột được cho nhịn đói hoàn toàn nhưng vẫn được uống nước tự do. Máu được lấy vào 24 giờ sau khi tiêm màng bụng P-407 và phân tích cac chỉ số lipid huyết thanh bao gồm TG, TC và HDL-C và non-HDL-C được tính theo công thức:

(non-HDL-C) = (TC) − (HDL-C).

2.2.3. Xử lý số liệu

Xử lý kết quả nghiên cứu: Tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá ̅X

± SD (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2016. So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng phân tích one–way ANOVA, hậu kiểm để so sánh giữa lô thử nghiệm với lô chứng (với thiết kế nghiên cứu từ 3 lô trở lên) hoặc dùng T-test ( với thiết kế nghiên cứu có 2 lô). Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Chương 3 - KẾT QUẢ

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

3.1.1. Tình trạng chung

Trong 90 ngày thí nghiệm, chuột ở các nhóm đều hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, ăn uống tốt, phân khô, lông mượt, không có chuột bị chết hoặc có các biểu hiện bất thường.

250

200

150

100

T0 T30

T60

THỜI GIAN (NGÀY)

T90

THỂ TRỌNG (MG)

3.1.2. Sự thay đổi trọng lượng chuột cống trắng

Lô chứng Lô trị Lô trị 2

Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến thể trọng chuột cống trắng

Hình 3.1 cho thấy sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống thuốc, mức độ gia tăng trọng lượng chuột cống trắng giữa hai lô trị với nhau và so với lô chứng khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05).

3.1.3. Đánh giá chức năng tạo máu

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng tạo máu chuột cống trắng

Lô	Trước khi uống cao chiết (T0)	Sau uống cao chiết
Lô	Trước khi uống cao chiết (T0)	T30	T60	T90
Số lượng hồng cầu (T/L)	Lô chứng	7,32 ± 0,54	7,49 ± 0,56	7,01 ± 0,67	7,07 ± 0,81
	Lô trị 1	7,53 ± 0,72	7,40 ± 0,66	7,19 ± 0,63	7,83 ± 0,78
	Lô trị 2	7,40 ± 0,66	7,42 ± 0,67	7,04 ± 0,58	7,07 ± 0,97
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Hàm lượng huyết sắc tố (g/L)	Lô chứng	12,03 ± 2,12	12,06 ± 1,26	11,78 ± 0,89	11,93 ± 0,91
	Lô trị 1	12,01 ± 1,16	11,80 ± 2,12	11,10 ± 1,19	11,67 ± 0,93
	Lô trị 2	12,12 ± 1,28	12,78 ± 0,79	11,67 ± 1,03	11,10 ± 1,09
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Hematocrit (%)	Lô chứng	35,21 ± 1,06	36,48 ± 3,89	35,33 ± 3,06	34,70 ± 2,36
	Lô trị 1	36,09 ± 3,11	35,86 ± 2,86	33,63 ± 1,85	33,63 ± 1,85
	Lô trị 2	36,11 ± 3,09	35,63 ± 3,96	35,76 ± 2,26	33,69 ± 2,93
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Thể tích trung bình hồng cầu (fL)	Lô chứng	47,37 ± 3,77	47,17 ± 1,69	47,16 ± 1,86	47,54 ± 1,86
	Lô trị 1	47,37 ± 3,80	47,37 ± 2,77	47,66 ± 2,33	46,69 ± 2,63
	Lô trị 2	48,23 ± 4,10	47,75 ± 2,95	47,17 ± 1,85	47,15 ± 1,97
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Số lượng bạch cầu (G/L)	Lô chứng	9,82 ± 2,41	9,76 ± 2,26	9,36 ± 1,99	9,56 ± 3,26
	Lô trị 1	9,91 ± 2,69	8,92 ± 2,03	9,68 ± 2,37	8,92 ± 2,03
	Lô trị 2	10,48 ± 2,45	9,66 ± 1,35	9,97 ± 2,64	10,29 ± 2,53
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Số lượng tiểu cầu (G/L)	Lô chứng	328,20 ± 53,72	330,80 ± 42,61	330,50 ± 70,71	333,10 ± 90,82
	Lô trị 1	323,40 ± 65,20	314,30 ± 80,11	379,70 ± 71,63	335,30 ± 54,47
	Lô trị 2	343,80 ± 41,02	314,50 ± 66,76	309,20 ± 69,09	318,80 ± 40,80
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 64 trang tài liệu này.

Chú thích:số liệu được trình bày dưới dạng 𝑋̅± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Kết quả bảng 3.1 cho thấy sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống cao chiết, các thông số máu không có sự thay đổi đáng kể nào về số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hematocrit, mức hemoglobin, số lượng tiểu cầu, tổng số bạch cầu và công thức bạch cầu giữa chuột cống ở lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.4. Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến độ hủy hoại tế bào gan chuột cống trắng

Lô	Trước khi uống cao chiết (T0)	Sau uống cao chiết
Lô	Trước khi uống cao chiết (T0)	T30	T60	T90
AST (UI/L)	Lô chứng	99,50 ± 30,11	89,30 ± 21,75	94,10 ± 29,68	99,80 ± 32,04
	Lô trị 1	89,60 ± 29,12	89,20 ± 22,37	100,20 ± 30,30	99,10 ± 20,30
	Lô trị 2	92,10 ± 29,53	88,10 ± 21,26	99,91 ± 29,19	97,30 ± 18,02
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
ALT (UI/L)	Lô chứng	51,20 ± 7,64	57,90 ± 8,90	56,30 ± 10,53	56,80 ± 15,58
	Lô trị 1	57,00 ± 16,65	57,50 ± 8,76	55,90 ± 10,88	53,10 ±15,90
	Lô trị 2	51,30 ± 9,31	56,80 ± 10,20	57,40 ± 11,76	58,50 ± 10,54
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05

Chú thích: số liệu được trình bày dưới dạng 𝑋̅± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Aspartat transaminase (AST) và Alanine transaminase (ALT) là 2 enzym để đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, sau 30, 60, 90 ngày uống cao chiết chè vằng, phân tích thống kê ALT, AST không có sự khác biệt đáng kể nào về giá trị trung bình giữa lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.5. Đánh giá chức năng gan

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng gan chuột cống trắng

Lô	Trước uống cao chiết (T0)	Sau uống cao chiết
Lô	Trước uống cao chiết (T0)	T30	T60	T90
Bilirubin toàn phần (mmol/L)	Lô chứng	13,49 ± 0,65	13,52 ± 0,81	13,53 ± 0,59	13,53 ± 0,51
	Lô trị 1	13,48 ± 0,49	13,90 ± 0,72	13,57 ± 0,75	13,75 ± 0,65
	Lô trị 2	13,50 ± 0,37	13,50 ± 0,55	13,50 ± 0,51	13,54 ± 0,59
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Nồng độ Albumin (g/L)	Lô chứng	29,10 ± 5,40	29,50 ± 3,30	27,70 ± 5,20	28,90 ± 6,70
	Lô trị 1	29,30 ± 3,30	33,0 0± 6,30	31,00 ± 6,00	25,70 ± 4,20
	Lô trị 2	29,10 ± 3,50	31,20 ± 4,20	27,80 ± 5,10	26,8 ± 3,90
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05
Nồng độ cholesterol (mmol/L)	Lô chứng	1,52 ± 0,20	1,69 ± 0,36	1,55 ± 0,29	1,46 ± 0,26
	Lô trị 1	1,63 ± 0,31	1,68 ± 0,39	1,56 ± 0,16	1,49 ± 0,16
	Lô trị 2	1,55 ± 0,20	1,61 ± 0,37	1,56 ± 0,31	1,67 ± 0,41
	p	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05

Chú thích: số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Bảng 3.3 cho thấy, sau 30, 60 và 90 ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa về bilirubin toàn phần, nồng độ albumin và nồng độ cholesterol toàn phần giữa các lô được điều trị bằng cao chiết và lô đối chứng. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Creatinin (mg/dl)

1.4

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

T30

T60

T90

Thời gian (ngày)

nồng độ Creatinin (mg/dl)

3.1.6. Đánh giá chức năng thận

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

Hình 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến nồng độ creatinin trong máu chuột cống trắng

Thông số thận (creatinin) được khảo sát để thăm dò chức năng thận. Kết quả trong hình chứng minh rằng sau thời gian điều trị, không có ảnh hưởng đáng kể đến creatinin của chuột cống trắng được ghi nhận ở lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.7. Thay đổi về mô bệnh học sau 90 ngày uống thuốc

Đại thể

Trên tất cả các chuột cống trắng thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận và hệ thống tiêu hoá.

Vi thể:

Hình thái vi thể gan:

+ Lô chứng: 3/3 mẫu bệnh phẩm gan có kết quả bình thường.

+ Lô trị 1: (uống cao chiết liều cao): 2/3 mẫu bệnh phẩm gan có thoái hóa nhẹ tế bào gan; 1/3 mẫu bệnh phẩm gan có kết quả bình thường.