Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng

MỞ ĐẦU

Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein:

Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3- MCPD, một chất độc gây ung thư.

Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng.

Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư.

Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm.

Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN

1.1.1 Cysteine protease [8, 9, 19, 34, 43]

Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30 kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.

Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.

Có hai loại cysteine proteases là exopeptidase (cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin...). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.

1.1.2 Papain

1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ]

Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.

1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41]

A: hoa cái B: hoa lưỡng tính C: hoa đực

D: trái của cây cái E: trái lưỡng tính F: cây đực

Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ.

Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae

Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái).

Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ.

1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.[7, 26, 33]

Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi.

1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ [8,41, 45]

1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.

2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan.

3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng.

4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.

5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu.

6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để

tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.

1.1.2.2 Tính chất của papain[8]

1.1.2.2.1 Tính chất vật lý

Tính chất vật lý	Giá trị
Điểm đẳng điện	pI = 8.75
Hằng số sa lắng S20	2.42 ± 0.04
Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2)	10.27 ± 0.13
Phân tử lượng	20,700
Độ triền quang [] D 20	-66.7o
Độ xoắn	17%
Vòng hiệu ứng cotton	290nm
Thể tích riêng phần V(mL/g)	0.724
Trị số ma sát f/fo	1.16
Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 96 trang tài liệu này.

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain

1.1.2.2.2 Tính chất hóa học[8, 34]

a) Cấu tạo hóa học

Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.

b) Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng

pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57OC.

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid

là:

Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.

Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động

của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau.

Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys. Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.

Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain

d) Phản ứng của papain[21, 22, 23, 35]

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.

Cys25 S

NH2

H N

C O HN R

His159

S - acyl hóa N

H2O

His159

RCO-NHR'

Cys25 S

Liên kết với chất nền

HNHis159

Cys25 S

R'NH2

H H

Thủy phân

His159

RCOOH

Cys25 S

C O

His159

Papain

S-S-CH3

+ R- SH

Đề acyl hóa

Papain

SH + R-S-S-CH3

Không hoạt động Hoạt động

NH +

C NH2 Cl

NH2

(CH2)3

Papain

(CH2)3

C HNHC C

NO2

HNHC

C OH3 +

O O

Không màu

O O

NO2

Có màu

Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain