Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 96 trang tài liệu này.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009

LỜI CẢM ƠN



Để hoàn thành chương trình cao học và luận văn này, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này.

Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng như thời gian em thực hiện luận văn này.

Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con có được thành quả như ngày hôm nay.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn.

Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2

1.1.1 Cysteine protease 2

1.1.2 Papain 2

1.1.2.1 Nguồn gốc 2

1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ 3

1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 4

1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong

cây đu đủ 4

1.1.2.2 Tính chất của papain 5

1.1.2.2.1 Tính chất vật lý 5

1.1.2.2.2 Tính chất hóa học 5

a) Cấu tạo hóa học5

b) Cấu trúc không gian6

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain7

d) Phản ứng của papain7

e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain9

1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain 10

1.1.2.3.1 Trong y học: 10

1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 10

1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 10

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 10

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 12

1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân12

1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân13

1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: 14

1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 14

1.3.5 Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân: 15

1.3.5.1 Ưu điểm 15

1.3.5.2 Nhược điểm 15

1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG

THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17

2.1.1. Hóa chất 17

2.1.2. Thiết bị 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18

2.2.1 Phương pháp trích nhựa đu đủ từ trái 18

2.2.2 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết 19

2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9 20

2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate 20

2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl 20

2.2.2.4 Kết tinh 20

2.2.2.5 Tái kết tinh 21

2.2.2.6 Đông khô chân không. 21

2.2.3 Xác định lượng protein theo phương pháp Lowry 22

2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phương pháp Anson 23

2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl 24

2.2.5.1 Nguyên tắc: 24

2.2.5.2 Cách tính: 24

2.2.6 Phương pháp xác định đạm formol (phương pháp Sorensen) 25

2.2.6.1 Nguyên tắc 25

2.2.6.2 Tiến hành 25

2.2.6.3 Cách tính 26

2.2.7 Xác định đạm amoniac 26

2.2.7.1 Nguyên tắc 26

2.2.7.2 Tiến hành 27

2.2.7.3 Cách tính 27

2.2.8 Phương pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thô. 27

2.2.8.1 Phương pháp loại béo: 27

2.2.8.2 Phương pháp thực hiện phản ứng 27

2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 KHẢO SÁT LƯỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ 30

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƯƠI 30

3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ 31

3.4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 33

3.5 PHƯƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 34

3.6 KHẢO SÁT LƯỢNG ENZYME THU ĐƯỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN

TINH CHẾ. 35

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN

TINH CHẾ 37

3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƯỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ

PHẨM PROTEASE THU ĐƯỢC THEO THỜI GIAN 39

3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM

THEO THỜI GIAN. 41

3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. 44

3.10.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH 44

3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 45

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO

THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. 46

3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. 49

3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian 50

3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian 57

3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.75% so với cơ chất 65

3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 1.00% so với cơ chất 72

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10

Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11

Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng 11

Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. 30

Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30

Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33

Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34

Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 36

Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38

Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40

Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42

Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44

Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45

Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. 47

Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. 47

Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. 47

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO

THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. 46

3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. 49

3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian 50

3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian 57

3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 0.75% so với cơ chất 65

3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lượng xúc tác là 1.00% so với cơ chất 72

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10

Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11

Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng 11

Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. 30

Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30

Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33

Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34

Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 36

Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38

Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40

Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42

Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44

Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45

Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. 47

Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50%

Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 55

Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 56

Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% 56

Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 58

Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 59

Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 59

Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 60

Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 61

Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 61

Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 62

Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 63

Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% 63

Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 65

Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 66

Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 66

Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 68

Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 68

Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 69

Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 70

Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 70

Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% 71

Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 72

Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 73

Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 74

Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 75

Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 75

Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 76

Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 77

Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 77

Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% 78

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. 33

Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. 34

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. .36 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. 39

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian 40

Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian 42

Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH 44

Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ 46

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng. 48

Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25% 52

Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25% 55

Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25% 57

Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50% 60

Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50% 62

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50% 64

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75% 67

Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.36 – 3.38. 67

Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75% 69

Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75% 71

Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00% 74

Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00% 76

Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00% 78

Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác khác nhau. 79