Bảng 3.13. Kết quả docking Maestro trên đích COX-1 (PDB ID: 6Y3C)
Tương tác 2D (2D Interaction) | Điểm docking | |
PH9 | -5,371 | |
6y3c_ aspirin (Điểm docking -6,191) | 6y3c_ ibuprofen (Điểm docking -6,292) | |
Có thể bạn quan tâm!
-
Sơ Đồ Phản Ứng Tổng Hợp Ph7 Với Tác Nhân 2-Bromoethanol -
Tổng Hợp Dẫn Chất Di-O-(2-(Glutaryloxy)Ethyl)Curcumin (Ph14) -
Các Kết Quả Phân Tích Phổ 1H-Nmr Các Dẫn Chất Ph1-Ph4, Ph5, Ph7, -
Kết Quả Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Nồng Độ Tác Nhân Tới Hiệu Suất Phản Ứng Ở Quy Mô 5 G/ Mẻ -
Kết Quả Khảo Sát Độ Lặp Lại Của Quy Trình Tổng Hợp Ph9 Ở Quy Mô 2 G/mẻ -
Đánh Giá Độc Tính Cấp Trên Chuột Thử Nghiệm Sơ Bộ:
Xem toàn bộ 442 trang tài liệu này.
Từ kết quả trên cho thấy, PH9 có nhiều trung tâm tương tác với đích COX-1 cho điểm số docking âm là -5,371, tương tự hai chất đối chiếu là aspirin và ibubrofen với điểm docking lần lượt là -6,191 và -6,292.
Để tìm hiểu các tác động ban đầu của PH9 với đích ung thư MCF7. Con đường được lựa chọn trong nghiên cứu này, 3ŀ-HSD3 (3ŀ-hydroxysteroid dehydrogenase type 3) được biết đến có thể cản trở 5ŀ-dihydrotestosteron, do đó sẽ làm tăng sự phát
triển của các tế bào ung thư vú ở phụ nữ [185]. Kết quả docking Maestro trên đích
MCF-7 (PDB ID 4XO6) được trình bày tại Bảng 3.14 sau:
Bảng 3.14. Kết quả docking Maestro trên đích MCF-7 (PDB ID: 4XO6)
Tương tác 2D (2D Interaction) | Liên kết hydro | Điểm docking | |
PH9 |
| ASN 167 TYR 272 ARG 276 SER 217 | -9,130 |
Ellipticin (chất so sánh) |
| ASN 167 | -7,740 |
Chú thích:
Từ kết quả trên cho thấy, PH9 có nhiều trung tâm tương tác với đích MCF-7 cho điểm số docking âm lớn hơn chất đối chiếu là Ellipticin. Ngoài ra trong tương tác hydro giữa hợp chất với các phần gốc (phần dư) amino acid, PH9 và Ellipticin đều cùng tạo liên kết ASN 167. Điều này cho thấy vị trí ASN 167 có thể là cơ chế tác động chung gây ức chế protein đích trong điều trị ung thư MCF-7. Bên cạnh đó, các tương tác hydrophobic, pi-pi stacking của PH9 và ellipticin cǜng có nhiều điểm tương đồng.
Dự đoán tính giống thuốc của dẫn chất PH9
- Các chỉ số liên quan đến cấu trúc phân tử:
Trọng lượng phân tử: Dẫn chất PH9 có trọng lượng phân tử là 512,51 g/mol. Trọng lượng phân tử của dẫn chất phù hợp với các hợp chất giống thuốc khi tham chiếu theo quy tắc Muegge (200 ≤ MW ≤ 600) [114].
Số trung tâm cho liên kết hydro: Trong phân tử PH9 có 2 trung tâm cho liên kết H, thỏa mãn tính giống thuốc theo quy tắc Lipinski (≤5) [94] và Muegge (≤5) [114].
Diện tích bề mặt phân cực của phân tử (TPSA): PH9 có TPSA = 145,66 thỏa mãn theo quy tắc Muegge TPSA≤150 [114].
Hệ số phân bố n-octanol/ nước: Dẫn chất PH9 có hệ số phân bố n-octanol/ nước theo SwissADME là XLOGP3 = 2,85 và MLOGP = 1,08 lần lượt đáp ứng tiêu chí của một hợp chất giống thuốc theo quy tắc Muegge (từ -2 đến 5) [114] và Lipinski (≤4,15) [94].
Độ tan trong nước: Theo dự đoán bằng công cụ SwissADME (độ tan theo ESOL 5,16*10-2 (mg/mL)) thì PH9 đều thuộc nhóm chất tan nhẹ trong nước, phù hợp cho tính chất giống thuốc theo quy tắc tham chiếu [41].
- Một số tính chất dược động học:
Dựa trên công cụ dự đoán SwissADME, PH9 có khả năng hấp thu thụ động qua ống tiêu hóa, tuy nhiên mức độ dự đoán ở mức thấp; có khả năng là chất ức chế các enzym liên quan đến quá trình chuyển hóa thuốc như: Enzym CYP2C9; CYP2C19; CYP2D6; và không ức chế enzym CYP1A2; CYP3A4.
- Về điểm sinh khả dụng:
PH9 có sinh khả dụng tốt theo đường uống với điểm sinh khả dụng là 0,56 (theo SwissADME).
Kết quả đánh giá tính giống thuốc cho thấy, PH9 có nhiều đặc tính tuân theo các quy tắc được sử dụng phổ biến hiện nay.
Như vậy, kết quả phân tích thực nghiệm Mục 3.2.1.1 và kết quả đánh giá in silico (Mục 3.2.1.2) chỉ ra dẫn chất PH9 là dẫn chất tiềm năng trong khuôn khổ luận án. Dẫn chất này sẽ được thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về xây dựng quy trình tổng hợp, từ đó đánh giá đặc tính lý hóa, sinh dược học, hoạt tính in vivo và độc tính cấp, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sau này hướng đến ứng dụng trong dược phẩm.
PH9 là một dẫn chất mới hoàn toàn, chưa từng được công bố trong các tài liệu tham khảo trước đó. Để tổng hợp dẫn chất PH9 có thể đi từ curcumin qua hai giai đoạn:
- Hydroxyethyl hóa curcumin tạo PH6 bằng một số tác nhân như: cloroethanol,
bromoethanol, ethylen oxyd...
- Succinyl hóa PH6 tạo PH9 bằng anhydrid succinic hoặc dạng succinyl clorid.
Do đó, để xây dựng được quy trình tổng hợp PH9, chúng tôi thực hiện hai nội dung: nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất trung gian PH6 từ curcumin, sau đó nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp PH9 từ PH6.
3.2.2. Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)- curcumin (PH6)
3.2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp PH6 ở quy mô phòng thí nghiệm
a, Khảo sát tác nhân hydroxylethyl hóa
Phản ứng alkyl hóa tổng hợp PH6 từ curcumin được thực hiện theo phương pháp của tác giả Changtam [33], được mô tả trong Mục 3.1.3.1. Trong phản ứng này, tác giả sử dụng tác nhân alkyl hóa là 2-bromoethanol. Ngoài tác nhân theo tham khảo, chúng tôi khảo sát thêm tác nhân 2-cloroethanol do 2-cloroethanol sẵn có, giá thành thấp hơn nhiều so với 2-bromoethanol.
Phản ứng được thực hiện như sau: 0,50 g (1,36 mmol; 1 eq) curcumin; 0,40 g (2,89 mmol) kali carbonat khan và 40 mL aceton (đã làm khan bằng kali carbonat khan) trong bình cầu hai cổ dung tích 250 mL trong 30 phút. Sau đó thêm từng giọt 0,46 mL (6,86 mmol; 5,0 eq) tác nhân 2-cloroethanol vào bình cầu trong quá trình hồi lưu hỗn hợp. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (3,0 : 7,0). Sau khi phản ứng kết thúc (12 giờ), để nguội khối phản ứng, lọc qua giấy lọc để loại các muối của kali. Cất chân không loại aceton ra khỏi khối phản ứng. Thêm 2 lần methanol, mỗi lần 10 mL để kéo bớt lượng tác nhân 2-cloroethanol còn dư. Phần chất còn lại trong bình cầu được hòa tan hoàn toàn trong 15 mL aceton. Sử dụng sắc ký cột để tách lấy sản phẩm tương tự như với tác nhân 2-bromoethanol. Kết
quả thu được 0,13 g tinh thể hình kim màu vàng cam PH6 (hiệu suất 23,2 %); SKLM:
Rf = 0,66 (cloroform : methanol = 9,0 : 1,0, v/v); nhiệt độ nóng chảy: 157,0–158,8
°C.
Như vậy, qua việc thực hiện nghiên cứu tổng hợp PH6 từ curcumin với hai tác nhân 2-cloroethanol và 2-bromoethanol nhận thấy: Sử dụng tác nhân 2-bromoethanol cho hiệu suất phản ứng cao hơn (37,4%), phản ứng xảy ra nhanh hơn (6h) so với tác nhân 2-cloroethanol (23,2% và 12h). Do vậy, chúng tôi lựa chọn tác nhân 2- bromoethanol để tổng hợp PH6 cho những thí nghiệm khảo sát về sau (Quy trình phản ứng thực hiện theo Mục 3.1.3.1 ở trên).
Sau khi phản ứng alkyl hóa curcumin với tác nhân 2-bromoethanol kết thúc, sắc ký thu được ngoài 1 vết sản phẩm, còn có vết curcumin nguyên liệu và 1 vết tạp khác, có thể là dialkyl hóa, do vậy, quá trình tinh chế rất quan trọng, ảnh hưởng nhiều tới hiệu suất phản ứng và chất lượng sản phẩm.
b, Khảo sát phương pháp tinh chế sản phẩm
- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột theo phương pháp của tác giả C. Changtam và cộng sự [33]:
Để nguội khối phản ứng, lọc loại các muối của kali. Cất chân không loại hết aceton. Hòa tan phần còn lại trong bình cầu với 100 mL dicloromethan rồi chuyển vào bình chiết dung tích 500 mL. Rửa pha hữu cơ bằng nước đến pH trung tính để loại hoàn toàn các muối của kali và một phần tác nhân dư. Làm khan pha hữu cơ bằng natri sulfat khan qua đêm. Lọc qua giấy lọc để loại chất làm khan.
Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột. Gộp các phân đoạn sản phẩm, cất thu hồi toàn bộ dung môi và thu sản phẩm, thu được 0,84 g bột vô định hình màu vàng cam PH6, hiệu suất 37,4 %, nhiệt độ nóng chảy: 158,8-159,7 °C.
Nhận xét: Phương pháp tinh chế này thu được hiệu suất cao, tuy nhiên lượng dung môi chạy sắc ký sử dụng nhiều, chi phí lớn, khó triển khai trên quy mô lớn khi nâng cấp quy mô.
Mặt khác, phân tử curcumin chứa 2 nhóm -OH phenol rất dễ tan trong kiềm, tạp dialkyl hóa dễ tan trong dung môi hữu cơ, nên có thể sử dụng phương pháp chiết để loại các tạp này.
- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp chiết:
Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội khối phản ứng, lọc loại các muối của kali. Cất chân không loại hết aceton. Hòa tan phần còn lại trong bình cầu với 100 mL dicloromethan rồi chuyển vào bình chiết dung tích 500 mL. Rửa pha hữu cơ bằng
nước đến pH trung tính để loại hoàn toàn các muối của kali và một phần tác nhân dư,
thu lấy pha hữu cơ.
Thêm 30 mL nước cất vào bình chiết, kiềm hóa bằng NaOH với pH pha nước
~ 12-13, chiết lấy pha nước kiềm 3 lần, gộp pha nước. Rửa lại pha nước với dicloromethan 3 lần, mỗi lần khoảng 15 mL. Acid hóa pha nước bằng acid hydrocloric 1M về pH 10, chiết 2 lần bằng dicloromethan (mỗi lần 100 mL). Gộp pha hữu cơ, rửa bằng nước đến pH trung tính. Làm khan pha hữu cơ bằng natri sulfat qua đêm, lọc loại chất làm khan. Cất loại dung môi. Kết tinh lại trong methanol thu tinh thể. Sấy sản phẩm ở 60 °C trong 2 giờ, cân, thu được 0,76 g bột vô định hình màu vàng cam PH6, hiệu suất 33,94 %, nhiệt độ nóng chảy: 158,5–159,8 °C.
Nhận xét: Hiệu suất thu được sản phẩm PH6 thấp hơn khi xử lý bằng phương pháp sắc ký cột, nhưng phương pháp tinh chế này có ưu điểm quy trình dễ thao tác, tiết kiệm thời gian, lượng dung môi hữu cơ sử dụng nhỏ hơn.
Vì vậy, tinh chế sản phẩm bằng phương pháp chiết được lựa chọn để tiếp tục khảo sát các yếu tố tiếp theo ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng: thời gian phản ứng, tỷ lệ mol, dung môi, nhiệt độ phản ứng, từ đó tìm ra các thông số tốt nhất cho quy trình phản ứng và nâng quy mô tổng hợp lên quy mô lớn hơn.
c, Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng: Tiến hành phản ứng theo Mục 3.1.3.1, sử dụng K2CO3 làm base, tỷ lệ mol 2-bromoethanol : curcumin = 2 : 1 và phản ứng ở 55 °C, tinh chế bằng phương pháp chiết; kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.15 dưới đây:
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo PH6
Thời gian phản ứng (giờ) | KL SP (g) | H % | |
1 | 5 | 0,61 | 27,24 |
2 | 6 | 0,76 | 33,94 |
3 | 7 | 0,72 | 32,15 |
4 | 8 | 0,68 | 30,37 |
Nhận xét: Ban đầu, khi tăng dần thời gian phản ứng thì hiệu suất phản ứng tăng lên. Từ 27,24 % sau 5 giờ lên tới 33,94 % sau 6 giờ. Tuy nhiên, khi tăng tiếp thời gian phản ứng thì hiệu suất tạo PH6 giảm. Vì vậy, thời gian phản ứng 6 giờ cho hiệu suất tạo sản phẩm monoalkyl cao nhất là 33,94 %.
d, Khảo sát ảnh hưởng của tỷ mol các chất tham gia phản ứng đến hiệu suất phản ứng
Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng đến hiệu suất phản ứng: Tiến hành phản ứng theo Mục 3.1.3.1, sử dụng K2CO3 làm base, thời gian phản ứng 6 giờ, ở nhiệt độ 55 °C và tinh chế bằng phương pháp chiết; kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.16 dưới đây:
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol các chất tham gia phản
ứng tới phản ứng tạo PH6
Tỷ lệ 2- bromoethanol : curcumin | Vết các thành phần trên SKLM | KL SP (g) | H % | |
1 | 0,5 : 1 | Vết Cur rất đậm, vết PH6 mờ nhạt | 0,24 | 10,72 |
2 | 1,0 : 1 | Vết Cur đậm, vết PH6 mờ | 0,52 | 23,22 |
3 | 1,5 : 1 | Vết Cur đậm, vết PH6 đậm hơn | 0,60 | 26,79 |
4 | 2,0 : 1 | Vết Cur ít đậm, vết PH6 đậm | 0,76 | 33,94 |
5 | 2,5 : 1 | Vết Cur ít đậm, vết PH6 đậm, vết sản phẩm phụ dialkyl đậm | 0,64 | 28,58 |
Nhận xét: Kết quả cho thấy, hiệu suất phản ứng tăng dần khi tăng tỷ lệ mol tác nhân 2-bromoethanol so với curcumin. Tuy nhiên, khi tăng tiếp tác nhân thì bắt đầu sản phẩm dialkyl được tạo ra nhiều hơn. Vì vậy, chúng tôi lựa tỷ lệ mol tốt nhất cho phản ứng là 2-bromoethanol : curcumin = 2,0 : 1.
e, Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng
Để khảo sát ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng: Tiến hành phản ứng theo Mục 3.1.3.1, sử dụng K2CO3 làm base, tỷ lệ mol 2-bromoethanol
: curcumin = 2 : 1 trong thời gian 6 giờ, tinh chế bằng phương pháp chiết; kết quả thu
được trình bày ở Bảng 3.17 dưới đây:
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng
Dung môi | Nhiệt độ (°C) | KL SP (g) | H % | |
1 | Aceton | 55 | 0,76 | 33,94 |
2 | 4-methyl-2-pentanon | 117 | 0,51 | 22,78 |
3 | Butan-2-on | 80 | 0,49 | 21,88 |
4 | Acetonitril | 80 | 0,18 | 8,04 |
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy, hiệu suất tạo PH6 cao nhất khi sử dụng dung môi aceton (33,94 %), dung môi này thông dụng, dễ cất loại khi tinh chế nên phù hợp
khi nâng cấp quy mô. Các dung môi còn lại: 4-methyl-2-pentanon, butan-2-on và acetonitril đều cho hiệu suất phản ứng thấp hơn, ngoài ra, các dung môi này có nhiệt độ sôi cao hơn, đòi hỏi nhiều năng lượng hơn khi cất loại, và giá thành cao nên khó thực hiện ở qui mô lớn.
g, Ảnh hưởng của dung môi khác thêm vào
Sử dụng hỗn hợp dung môi có thể làm thay đổi hiệu suất và thời gian phản ứng. Trong phản ứng này, chúng tôi tiến hành khảo sát lượng dung môi DMF thêm vào mỗi lượng aceton nhất định đến phản ứng với các yếu tố cố định: tỷ lệ mol 2- bromoethanol : curcumin = 2,0 : 1, dung môi aceton, sử dụng K2CO3 làm base và phản ứng ở 55 °C trong 6 giờ, kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.18 sau:
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi DMF thêm vào
Lượng DMF thêm vào mỗi 80 mL aceton (mL) | KL SP (g) | H % | |
1 | 0 | 0,76 | 33,94 |
2 | 1 | 0,79 | 35,28 |
3 | 2 | 0,83 | 37,07 |
4 | 3 | 0,82 | 36,62 |
Nhận xét: Việc sử dụng phối hợp DMF với aceton làm tăng hiệu suất của phản
ứng. Tỷ lệ thể tích aceton : DMF = 80 : 2 cho hiệu suất tốt nhất.
Như vậy, thông qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng tổng hợp PH6, các thông số tốt nhất cho phản ứng thu được như Bảng 3.19 sau:
Bảng 3.19. Các thông số tốt nhất cho quy trình tổng hợp PH6
Tỷ lệ 2- bromoethanol : curcumin | Dung môi | toC phản ứng | Thời gian phản ứng (giờ) | KL SP (g) | H % | |
Sử dụng phương pháp chiết | 2 : 1 | aceton : DMF = 80 : 2 | 55 °C | 6 | 0,92 | 41,09 |
3.2.2.2. Nâng quy mô tổng hợp PH6 lên 5 g/mẻ
Tiến hành phản ứng với các thông số tốt nhất thu được ở trên với quy mô sử dụng 10 g nguyên liệu curcumin:
Khuấy hỗn hợp 10,00 g (27,15 mmol; 1 eq) curcumin; 18,80 g (135,64 mmol; 5,0 eq) K2CO3 khan; 400 mL aceton khan; 10,0 mL DMF trong bình cầu 1000 mL trong thời gian 30 phút để hoạt hóa. Thêm 3,60 mL (54,40 mmol; 2,0 eq) tác nhân 2-