phản ứng (100 °C) trong 2 giờ. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9,0 : 1,0).
Sau khi phản ứng kết thúc, để làm lạnh khối phản ứng. Chuyển hỗn hợp phản ứng vào bình chiết 1000 mL, thêm 300 mL dicloromethan. Tiến hành chiết với dung dịch HCl 1M lạnh 3 lần, mỗi lần 20 mL và thu lấy pha hữu cơ. Rửa pha dicloromethan với dung dịch NaCl bão hòa lạnh 3 lần, mỗi lần 20 mL. Sau đó rửa pha hữu cơ với nước lạnh 3 lần, mỗi lần 20 mL. Làm khan bằng Na2SO4 khan 30 phút, lọc loại chất làm khan. Cất chân không loại bỏ dicloromethan ở nhiệt độ 30 °C đến khi lượng dịch còn khoảng 5 mL, để kết tinh thu được tủa. Lọc, sấy và cân sản phẩm, cân thu được 1,58 g sản phẩm là tinh thể hình kim màu vàng cam, hiệu suất phản ứng 63,58%.
Nhận xét: Khi nâng cấp lên quy mô 2 g/mẻ thì hiệu suất phản ứng bị giảm mạnh. Nguyên nhân có thể là do lượng HCl dùng để loại pyridin trong giai đoạn tinh chế đã làm thủy phân một phần ester. Vì vậy, để quá trình tinh chế giảm lượng ester thủy phân và đảm bảo loại hết tạp pyridin, chúng tôi đã tiến hành một số cải tiến như sau:
Để loại pyridin, sử dụng dung dịch CuSO4 bão hòa để tạo phức tan trong nước thay vì sử dụng dung dịch HCl 1M tạo muối tan trong nước do muối CuSO4 có tính acid yếu hơn dung dịch HCl 1M sẽ làm giảm khả năng thủy phân liên kết ester.
Tinh chế sản phẩm: cất loại bỏ hoàn toàn dung môi để thu tủa sau đó rửa tủa với methanol để loại tạp thay vì cất loại dicloromethan đến dịch đặc sau đó kết tinh thu tủa. Với phương pháp này, sản phẩm thu được sẽ tinh khiết hơn, ít bị mất trong dịch lọc do so với dicloromethan, độ tan của PH9 và tạp chất trong methanol có sự khác biệt đáng kể hơn nên methanol dễ hoà tan tạp mà ít hòa tan tủa.
Từ các thay đổi trên, chúng tôi tiến hành nâng cấp qui mô tổng hợp lên 2 g/mẻ với qui trình tổng hợp như sau (Qui trình cải tiến):
Cho hỗn hợp 2,00 g (4,85 mmol; 1 eq) PH6; 1,00 g (9,70 mmol; 2,0 eq) anhydrid succinic; 2,0 mL pyridin khan vào bình cầu 100 mL. Khuấy và đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng (100 °C) trong 2 giờ. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9,0 : 1,0).
Sau khi phản ứng kết thúc, để làm lạnh khối phản ứng. Chuyển hỗn hợp phản ứng vào bình chiết 1000 mL, thêm 300 mL dicloromethan. Tiến hành rửa pha hữu cơ với dung dịch CuSO4 bão hòa lạnh (3 lần, mỗi lần 100 mL). Sau đó rửa lại pha hữu cơ với nước lạnh 3 lần, mỗi lần 100 mL. Làm khan bằng Na2SO4 khan 30 phút. Lọc loại chất làm khan. Cất quay chân không loại bỏ hoàn toàn dicloromethan, xuất hiện tủa bám trên thành bình cầu. Rửa tủa bằng methanol, lọc, sấy khô sản phẩm ở 60 °C.
Làm 3 mẻ khảo sát độ lặp lại của quy trình tổng hợp thu được kết quả như Bảng
3.28 sau:
Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình tổng hợp PH9 ở quy mô 2 g/mẻ
Cảm quan | Khối lượng chất PH9 (g) | Hiệu suất (%) | t°nc (°C) | |
1 | Tinh thể hình kim màu vàng cam | 1,85 | 74,44 | 163,2–165,3 |
2 | Tinh thể hình kim màu vàng cam | 1,80 | 72,43 | 162,7–165,0 |
3 | Tinh thể hình kim màu vàng cam | 1,86 | 74,84 | 163,0–165,5 |
Trung bình | 1,84 | 73,90 | 163,0-165,3 | |
RSD% | 1,75 | 1,75 | ||
Có thể bạn quan tâm!
-
Các Kết Quả Phân Tích Phổ 1H-Nmr Các Dẫn Chất Ph1-Ph4, Ph5, Ph7, -
Kết Quả Docking Maestro Trên Đích Cox-1 (Pdb Id: 6Y3C) -
Kết Quả Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Nồng Độ Tác Nhân Tới Hiệu Suất Phản Ứng Ở Quy Mô 5 G/ Mẻ -
Đánh Giá Độc Tính Cấp Trên Chuột Thử Nghiệm Sơ Bộ: -
Bàn Luận Về Phản Ứng Tạo Các Dẫn Chất Monoester Glutarat (Ph8) Và Succinat (Ph9 Và Ph10) -
Cấu Trúc Ph3 Và Các Giá Trị Tín Hiệu Proton, Carbon Trong Phân Tử Trên Phổ Nmr
Xem toàn bộ 442 trang tài liệu này.
Nhận xét: Với quy trình tương tự như quy mô thí nghiệm và có cải tiến cho hiệu suất ổn định khi tiến hành nâng quy mô tổng hợp PH9 lên 2 g/mẻ.
3.2.3.3. Nâng quy mô tổng hợp PH9 lên 20 g/mẻ
Sử dụng những cải tiến ở quy mô 2 g/mẻ, tiến hành thực hiện phản ứng tổng hợp
PH9 ở quy mô 20 g/mẻ. Quy trình thực hiện như sau:
Cho hỗn hợp 20,00 g (48,5 mmol; 1 eq) PH6; 10,00 g (97,0 mmol; 2,0 eq) anhydrid succinic; 20,0 mL pyridin khan vào bình cầu 500 mL. Khuấy và đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng (~ 100 °C) trong 2 giờ. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan : methanol (9,0 : 1,0).
Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội khối phản ứng về nhiệt độ phòng. Hòa tan khối phản ứng với 3,0 L dicloromethan, chia thành 2 mẻ.
Với mỗi mẻ, chuyển hỗn hợp phản ứng vào bình chiết 2000 mL. Tiến hành rửa pha hữu cơ với dung dịch CuSO4 bão hòa lạnh (3 lần, mỗi lần 300 mL). Sau đó rửa lại pha hữu cơ với nước lạnh 3 lần, mỗi lần 300 mL. Làm khan bằng Na2SO4 khan trong 30 phút. Lọc loại chất làm khan. Thu các phần của khối phản ứng, cất quay chân không loại bỏ hoàn toàn dicloromethan ở nhiệt độ 50 °C, thu tủa bám trên thành bình cầu. Rửa tủa bằng methanol, lọc, sấy ở 40 °C, thu được 18,10 g PH9. Hiệu suất phản ứng đạt 72,83 %, nhiệt độ nóng chảy 163,1–165,5 °C.
Nhận xét: Khi nâng cấp quy mô phản ứng từ 2 g lên 20 g, phản ứng xảy ra ổn định. Kết quả các khảo sát phản ứng, xây dựng quy trình và nâng quy mô tổng hợp dẫn chất PH9 được tóm tắt trong Bảng 3.29 sau:
Bảng 3.29. Bảng tóm tắt kết quả khảo sát phản ứng, xây dựng quy trình và nâng quy mô tổng hợp PH9
0,2 g/mẻ | 2 g/mẻ | 20 g | |
KL nguyên liệu curcumin (g) | 0,2 | 2 | 20 |
Khối lượng anhydrid (g) | 0,10 | 1,00 | 10,00 |
Tỷ lệ mol tác nhân : PH6 | 2 : 1 | 2 : 1 | 2 : 1 |
Nhiệt độ phản ứng (°C) | 100 | 100 | 100 |
Thời gian phản ứng (giờ) | 2 | 2 | 2 |
Phương pháp loại pyridin | HCl 1M | CuSO4 bão hòa | CuSO4 bão hòa |
Tỷ lệ dung môi DCM dùng để tinh chế/nguyên liệu (mL/g) | 60/0,2 | 300/2 | 3000/20 |
Dung môi kết tinh | DCM | Methanol | Methanol |
KL sản phẩm (g) | 0,18 | 1,84 | 18,1 |
Hiệu suất (%) | 72,43 | 73,90 | 72,83 |
Sơ đồ quy trình tổng hợp PH9 như Hình 3.3 sau:
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp PH9
3.2.4. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của dẫn chất mono-O-(2- (succinyloxy)ethyl)curcumin (PH9) và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở
3.2.4.1. Đánh giá độ tinh khiết của chất PH9
Độ tinh khiết của sản phẩm PH9 thu được ở quy trình nâng cấp được kiểm tra bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, phân tích các dữ liệu phổ và định lượng bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích pic trong HPLC. Kết quả được thể hiện trong các Bảng 3.30 và Bảng 3.31 dưới đây:
Phương pháp sắc ký lớp mỏng:
Bảng 3.30. Kết quả sắc ký lớp mỏng của dẫn chất PH9 thu được ở quy mô 20 g/mẻ
Hệ dung môi | Rf | Ghi chú | |
1 | CHCl3 : MeOH : acid acetic = 9,0 : 1,0 : 0,1 | 0,51 | 1 vết tròn gọn, không có vết phụ |
2 | CH2Cl2 : MeOH = 20,0 : 1,0 | 0,25 | 1 vết tròn gọn, không có vết phụ |
3 | CH2Cl2 : MeOH = 9,0 : 1,0 | 0,42 | 1 vết tròn gọn, không có vết phụ |
4 | EtOAc : n-hexan = 7,0 : 3,0 | 0,21 | 1 vết tròn gọn, không có vết phụ |
5 | n-butanol : acid acetic : nước = 9,0 : 2,0 : 2,5 | 0,80 | 1 vết tròn gọn, không có vết phụ |
Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.30, kết hợp với số liệu đo nhiệt độ nóng chảy (163,1- 165,5 °C) với khoảng chảy hẹp (ȍ = 2,4 °C) có thể khẳng định, sản phẩm thu được là tinh khiết.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: Kết quả định lượng bằng chuẩn hóa diện tích của dung dịch PH9 trong nước thu được như Bảng 3.31 sau:
Bảng 3.31. Kết quả hàm lượng PH9 theo phương pháp chuẩn hóa diện tích
Diện tích pic PH9 | Tổng diện tích các píc trong phổ đồ | Hàm lượng (%) | |
1 | 285343 | 296557 | 96,22 |
2 | 285100 | 296741 | 96,08 |
3 | 290970 | 300427 | 96,85 |
Trung bình | 96,38 | ||
RSD | 0,41 | ||
Nhận xét: Hàm lượng của PH9 tính theo phương pháp chuẩn hóa diện tích là 96,38
±0,41% [Phụ lục 157].
Phương pháp phân tích phổ: Các giá trị phân tích phổ của PH9 thu được từ 2
quy mô tương tự nhau, trên phổ đồ phổ hồng ngoại đều xuất hiện đủ các đỉnh hấp thụ
đặc trưng của các nhóm chức có mặt trong công thức, và trên phổ đồ cộng hưởng từ, xuất hiện đầy đủ bộ tín hiệu của các proton và carbon có mặt trong công thức, hầu như không quan sát thấy tạp khác [Phụ lục 115 - 124]. Dữ liệu phổ hai chiều (COSY, HSQC, HMBC) của PH9 thu được ở quy mô 20 g/mẻ được thể hiện tại phần bàn luận và Phụ lục 125 - 134.
3.2.4.2. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của dẫn chất PH9
Đánh giá một số chỉ tiêu về chất lượng của dẫn chất PH9 theo hướng dẫn trong
Dược điển Việt Nam V tại ba lô nghiên cứu thu được kết quả như Bảng 3.32 sau:
Bảng 3.32. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của PH9
Chỉ tiêu chất lượng | Yêu cầu | Phương pháp thử | Kết quả | Trung bình±SD | |||
Lô 1 | Lô 2 | Lô 3 | |||||
1 | Tính | Bột vô định hình màu | Bằng cảm | Bằng cảm quan, chế | |||
chất | cam | quan, chế | phẩm phải đạt các yêu | ||||
phẩm phải | cầu đã nêu | ||||||
đạt các yêu | |||||||
cầu đã nêu | |||||||
2 | Định | Phổ hấp thụ hồng | Thử theo | Đạt | Đạt | ||
tính: | ngoại của chế phẩm | Dược điển | |||||
phải phù hợp với phổ | Việt Nam V | ||||||
Phổ | hấp thụ hồng ngoại | – Phụ lục 4.2 | |||||
hồng | của mono-O-(2- | ||||||
ngoại | (succinyloxy)ethyl)- | ||||||
curcumin | |||||||
Nhiệt | 162,0 - 165,5 oC | Thử DĐVN | Đạt | ||||
độ | V - Phụ lục | 163,2- | 162,7- | 163,0- | |||
nóng | 6.7 | 165,3 | 165,0 | 165,5 | |||
chảy | |||||||
3 | Độ ẩm | Không lớn hơn 3% | Thử DĐVN V - Phụ lục 9.6 | 1,2 | 1,3 | 1,4 | 1,30 ± 0,1 |
4 | Tro toàn phần | Không lớn hơn 1% | Thử DĐVN V - Phụ lục 9.8 (phương pháp 2) | 0,96 | 0,94 | 0,95 | 0,95 ± 0,01 |
5 | Định | Hàm lượng chất | Sắc ký lỏng | 96,22 | 96,08 | 96,85 | 96,38 |
lượng | không nhỏ hơn 95,0 | hiệu năng | ± 0,41 | ||||
% tính theo nguyên | cao | ||||||
trạng | |||||||
Từ kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của ba lô nghiên cứu, để xuất giới hạn các chỉ tiêu tiêu chuẩn cơ sơ của dẫn chất tiềm năng như Bảng 3.33 sau:
Bảng 3.33. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của dẫn chất tiềm năng
Chỉ tiêu chất lượng | Yêu cầu | Phương pháp thử | |
1 | Tính chất | Bột vô định hình màu cam | Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu |
2 | Định tính: Phổ hồng ngoại | Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của mono-O-(2- (succinyloxy)ethyl)curcumin | Thử theo Dược điển Việt Nam V – Phụ lục 4.2 |
Nhiệt độ nóng chảy | 162,0 - 165,5 oC | Thử DĐVN V - Phụ lục 6.7 | |
3 | Độ ẩm | Không lớn hơn 3% | Thử DĐVN V - Phụ lục 9.6 |
4 | Tro toàn phần | Không lớn hơn 1% | Thử DĐVN V - Phụ lục 9.8 (phương pháp 2) |
5 | Định lượng | Hàm lượng chất không nhỏ hơn 95,0 % tính theo nguyên trạng | Sắc ký lỏng hiệu năng cao |
3.2.5. Đánh giá một số đặc tính sinh dược học của dẫn chất mono-O-(2- (succinyloxy)ethyl)curcumin (PH9)
3.2.5.1. Đánh giá độ tan in vitro của PH9 trong các môi trường pH khác nhau
Dẫn chất PH9 và curcumin được đánh giá độ tan trong các pH khác nhau: pH 1,2; pH 4,5, nước, pH 6,8; pH 7,4, ở 25±2 oC và áp suất khí quyển; thực hiện theo Mục
2.3.4 và Mục 2.3.6.1 thu được kết quả như trên Bảng 3.34 dưới đây:
Bảng 3.34. Kết quả độ tan của curcumin và PH9 tại các môi trường pH khác nhau
Curcumin | PH9 | |||
Độ tan (mg/mL) | Ghi chú* | Độ tan (mg/mL) | Ghi chú* | |
Nước cất | 0,021 ± 0,003 | thực tế không tan | 8,497 ± 0,123 | Khó tan |
pH 1,2 | 0,011 ± 0,001 | thực tế không tan | 1,344 ± 0,049 | Khó tan |
pH 4,5 | 0,015 ± 0,003 | thực tế không tan | 6,457 ± 0,072 | Khó tan |
pH 6,8 | 0,011 ± 0,001 | thực tế không tan | 16,475 ± 0,130 | Hơi tan |
pH 7,4 | 0,02 ±0,002 | thực tế không tan | 17,373 ± 0,109 | Hơi tan |
* Phân loại theo hướng dẫn tại Dược điển Việt Nam V [4]
Nhận xét: Curcumin thực tế không tan trong các môi trường pH khác nhau. Khi biến đổi cấu trúc của curcumin thêm nhóm chức acid succinic, độ tan dẫn chất tăng lên đáng kể trong các môi trường pH khác nhau. Trong nước, dẫn chất PH9 có độ tan gấp 425 lần so với curcumin. Còn trong các môi trường pH 6,8 và pH 7,4; PH9 tan tốt hơn curcumin gấp khoảng 1000 lần và thuộc nhóm chất hơi tan theo phân loại trong Dược điển Việt Nam V. Như vậy, từ kết quả trên cho thấy, PH9 đã cải thiện được độ tan trong các môi trường pH khác nhau đáng kể so với curcumin.
3.2.5.2. Xác định giá trị hệ số phân bố n-octanol/nước của dẫn chất PH9
Sử dụng phương pháp phân tích PH9 được trình bày trong Mục 2.3.5.2 và tiến hành đánh giá hệ số hệ số phân bố log DpH của PH9 như Mục 2.3.5.2. Thí nghiệm được thực hiện ở 25±2 oC, áp suất khí quyển. Do mẫu curcumin thực tế không tan trong các môi trường pH khác nhau, nên với mẫu curcumin không tính được giá trị hệ số phân bố thực tế tại một số môi trường pH. Kết quả log DpH được trình bày tại Bảng 3.35.
Bảng 3.35. Kết quả log DpH của PH9 tại các môi trường pH khác nhau
S1 | S2 | (S1-S2)/S2 | Log D | |
Nước cất | 285221,5 | 63640 | 3,482 ± 0,041 | 0,542 ± 0,005 |
1,2 | 15436,5 | 0 | 15436,5 / 0 | - |
4,5 | 196175,5 | 25793 | 6,606 ± 0,034 | 0,820 ± 0,002 |
6,8 | 441308 | 161287 | 1,736 ± 0,014 | 0,239 ± 0,004 |
7,4 | 470072,5 | 365382,5 | 0,287 ± 0,004 | -0,543± 0,006 |
Nhận xét:
Trong môi trường pH 1,2, gần như hoàn toàn phân tử PH9 trong pha nước chuyển hết sang pha n-octanol. Trong môi trường pH 4,5, phần lớn PH9 chuyển sang pha n- octanol. Khi tăng dần pH môi trường, thì lượng chất tan PH9 chuyển sang pha n- octanol ít hơn và ở lại pha nước phần nhiều hơn.
Trong môi trường nước tỷ lệ PH9 chuyển sang pha n-octanol chiếm 77 % so với tổng lượng chất tan ban đầu. Các giá trị log D của PH9 tại các môi trường pH khác nhau tiến gần tới 0, có nghĩa là tỷ lệ tan trong dầu và trong nước của PH9 gần bằng nhau, khả năng thấm qua màng phospholipid kép tốt hơn so với các chất có log P quá nhỏ hoặc quá lớn. Điều này chứng tỏ, dẫn chất PH9 có độ tan và tính thấm tốt [Phụ lục 155 - 158].
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ ĐỘC TÍNH CẤP TRÊN CHUỘT CỦA DẪN CHẤT MONO-O-(2-(SUCCINYLOXY)ETHYL)- CURCUMIN (PH9)
3.3.1. Đánh giá hoạt tính kháng viêm trên tai chuột theo đường bôi ngoài da
Tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng viêm của mẫu PH9 trên tai chuột theo phương pháp được trình bày tại Mục 2.3.7.
Kết quả thu được về hoạt tính kháng viêm tai của PH9 và curcumin được trình bày ở Bảng 3.36 sau:
Bảng 3.36. Độ sưng phù của tai theo thời gian
Độ sưng phù của tai theo thời gian (mm) (n=6) | |||||
15 phút | 30 phút | 60 phút | 90 phút | 120 phút | |
Đối chứng | 0,253±0,074 | 0,215±0,032 | 0,153±0,045 | 0,097±0,040 | 0,068±0,042 |
PH9 | 0,197±0,051 | 0,153**±0,040 | 0,107*±0,040 | 0,067±0,027 | 0,048±0,016 |
Curcumin | 0,212± 0,058 | 0,208# ± 0,047 | 0,177#±0,038 | 0,092±0,032 | 0,068±0,013 |
Dexa | 0,138** ±0,023 | 0,117*±0,016 | 0,072*±0,013 | 0,058 ± 0,027 | 0,043±0,024 |
Ghi chú: * P<0,05 và **P<0,01 là có sự sai khác so với đối chứng bệnh lí ở mức ý nghĩa thống kê so với đối chứng; # P<0,05 sai khác có ý nghĩa thống kê của kết quả curcumin so với PH9;
Nhận xét: Mẫu PH9 liều 2 mg/20 µL/tai đã thể hiện hoạt tính kháng viêm theo đường bôi trong thí nghiệm này ở hai thời điểm đo là 30 phút và 60 phút, và ở mức sai khác này có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng bệnh lý.
Mẫu curcumin liều 2 mg/20 µL/tai chưa thể hiện hoạt tính kháng viêm theo đường bôi trong thí nghiệm này tại các thời điểm nghiên cứu ở mức có ý nghĩa thống kê (P>0,05).
Mẫu PH9 cùng mức liều đã thể hiện hoạt tính kháng viêm theo đường bôi trong thí nghiệm này ở hai thời điểm đo là 30 phút và 60 phút, và hoạt tính thể hiện giảm độ sưng phù tai sai khác ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với mẫu curcumin ở cùng mức liều và cùng thời điểm [Phụ lục 153].