Đánh Giá Độc Tính Cấp Trên Chuột Thử Nghiệm Sơ Bộ:

3.3.2. Đánh giá độc tính cấp trên chuột Thử nghiệm sơ bộ:

Cho 10 chuột nhắt trắng (sau khi bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ) uống mẫu nghiên cứu PH9 ở mức liều cao nhất là 10000 mg/kg thể trọng (theo Mục 2.3.8). Trong vòng 24h sau khi uống mẫu, quan sát và theo dõi không có chuột bị chết nên thử nghiệm chính thức đã được tiến hành ngay.

Thử nghiệm chính thức:

60 chuột nhắt trắng dòng BALB/c khoẻ mạnh, được chia làm 6 lô (10 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ trước khi được uống mẫu nghiên cứu. Sau đó, từng lô được uống các mẫu chất PH9 với các mức liều như sau: Lô 1: Lô chứng trắng uống 0.2 ml nước cất khử trùng/con; Lô 2: Uống PH9 liều 1250 mg/kg; Lô 3. Uống PH9 liều 2500 mg/kg; Lô 4. Uống PH9 liều 5000 mg/kg; Lô 5: Uống PH9 liều 7500 mg/kg; Lô 6: Uống PH9 liều 10000 mg/kg. Sau đó, đánh giá này về số lượng chuột chết, biểu hiện bên ngoài chuột, khối lượng cơ thể chuột, tiêu thụ thức ăn và nước uống và quan sát dấu hiệu ngộ độc thu được kết quả tại các Bảng 3.37 - 3.38 như sau:

- Xác định số chuột chết và quan sát biểu hiện bên ngoài

Bảng 3.37. Số lượng chuột chết, biểu hiện bên ngoài khi uống mẫu

Lô

Uống	Số chuột chết trong 72 giờ	Biểu hiện bên ngoài trong vòng 0–72 giờ
1.	Đối chứng (uống nước)	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
2.	PH9 liều 1250 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
3.	PH9 liều 2000 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
4.	PH9 liều 2500 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
5.	PH9 liều 5000 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
6.	PH9 liều 7500 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt
7.	PH9 liều 10000 mg/kg	0	Sau khi uống mẫu, chuột di chuyển và ăn uống bình thường, phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 442 trang tài liệu này.

Kết quả thí nghiệm trên cho thấy: Uống PH9 liều 1250 mg/kg đến 10000 mg/kg không chết động vật thí nghiệm và an toàn theo đường uống trong thí nghiệm này.

Khối lượng cơ thể chuột

Khối lượng cơ thể chuột thí nghiệm được theo dõi trong 07 ngày kể từ khi uống mẫu thử. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.38.

Bảng 3.38. Kết quả theo dõi khối lượng của chuột ở các lô

Lô thí nghiệm

Khối lượng trung bình của chuột thí nghiệm (n=10)
Trước khi uống	ngày 1	ngày 4	ngày 7
Đối chứng nước	20,24 ± 0,33	20,67 ± 0,29	21,62 ± 0,16	23,17 ± 0,23
PH9 liều 1250 mg/kg	20,21 ± 0,32	20,68 ± 0,31	21,75 ± 0,12	22,98 ± 0,29
PH9 liều 2500 mg/kg	20,27 ± 0,15	20,72 ± 0,26	21,69 ± 0,22	22,92 ± 0,32
PH9 liều 5000 mg/kg	20,29 ± 0,21	20,78 ± 0,23	21,76 ± 0,18	23,03 ± 0,24
PH9 liều 7500 mg/kg	20,48 ± 0,23	20,76 ± 0,16	22,83 ± 0,34	22,92 ± 0,35
PH9 liều 10000 mg/kg	20,57 ± 0,27	20,88 ± 0,11	21,71 ± 0,04	22,98 ± 0,51
P*	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05

Ghi chú: * P < 0,05 là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng

Kết quả trên cho thấy:

Trước khi uống mẫu thử: Khối lượng trung bình của chuột ở các nhóm thử liều từ 1250 - 10000 mg/kg trước khi đưa vào thử nghiệm không có sự khác biệt so với nhóm chứng (P>0,05).

Sau khi uống mẫu thử 1 ngày, 4 ngày và 7 ngày: khối lượng chuột thí nghiệm ở nhóm chứng và nhóm thử không có sự khác biệt (P > 0,05). Kết quả thu được chứng tỏ mẫu thử nghiệm PH9 không ảnh hưởng đến quá trình phát triển bình thường của chuột.

Tiêu thụ thức ăn và nước uống của chuột

Nhóm đối chứng: chuột hoạt động và ăn uống bình thường.

Mẫu thử nghiệm: Nhóm uống mẫu PH9 ở các mức liều nghiên cứu từ 1250 mg/kg

- 10000 mg/kg cho thấy chuột tiêu thụ nước uống, thức ăn bình thường.

Quan sát dấu hiệu ngộ độc

Sau khi uống mẫu thử nghiệm PH9 liều 10 g/kg thể trọng, không có con chuột nào bị chết, không quan sát thấy hiện tượng bất thường về thần kinh hay hiện tượng tiêu

chảy ở các chuột thí nghiệm, lông của chuột mượt; tiêu thụ thức ăn, nước uống bình thường; phản xạ ánh sáng và âm thanh tốt. Điều này cho thấy mẫu thử nghiệm PH9 là an toàn không gây độc tính cấp với liều thử cao nhất là 10 g/kg thể trọng.

Dựa trên kết quả thu được của thử nghiệm này có thể kết luận mẫu thử nghiệm

PH9 thuộc nhóm không gây độc theo đường uống.

Kết luận: Mẫu PH9 thuộc nhóm không gây độc cấp tính theo đường uống thử nghiệm trên chuột nhắt trắng với mức liều tối đa 10 g/kg thể trọng [Phụ lục 154].

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. BÀN LUẬN VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC

4.1.1. Bàn luận về phản ứng tạo dẫn chất acid carboxylic (PH3) và muối carboxylat (PH4)

4.1.1.1. Về phản ứng alkyl hóa tổng hợp dẫn chất PH1 và PH2

Các phản ứng alkyl hóa curcumin tạo PH1 và PH2 đều xảy ra không chọn lọc trên các nhóm chức của curcumin. SKLM của hỗn hợp phản ứng cho thấy, sản phẩm tạo ra có thể là curcumin gắn thêm từ 1 đến 4 nhóm alkyl ở các vị trí nhóm hydroxyl và nhóm methylen hoạt động. Điều này tạo ra khó khăn trong quá trình alkyl hóa chọn lọc ở vị trí xác định cǜng như quá trình tinh chế sản phẩm và nâng cao hiệu suất phản ứng.

Phản ứng được tiến hành ở điều kiện tương tự với tài liệu [119]. Theo tài liệu, các tác giả sử dụng tác nhân là methyl cloroacetat thu được sản phẩm là mono- và di-O-methoxycarbonylmethyl curcumin. Trong khi đó, chúng tôi thu được một sản phẩm duy nhất, và sản phẩm này có thêm 2 nhóm methoxycarbonylmethyl (ethoxycarbonylmethyl) ở vị trí C-4. Điều này là do nhóm methylen tại vị trí C-4 thuộc cấu trúc ß-diceton nên hai hydro ở vị trí này trở lên linh động và dễ dàng bị alkyl hóa trong môi trường có chất xúc tiến K2CO3. Quan sát trên SKLM có thể thấy phản ứng xảy ra ở vị trí -OH phenol trước. Chính vì thế, tỉ lệ mol các chất phản ứng, tốc độ đưa tác nhân alkyl hóa, lượng base (kali carbonat), thời gian phản ứng là các yếu tố quan trọng, quyết định sản phẩm alkyl hóa được tạo ra. Để thu được duy nhất sản phẩm PH1 hoặc PH2, chúng tôi tiến hành phản ứng với tỉ lệ mol tác nhân alkyl cloroacetat : curcumin là 45 : 1, thời gian phản ứng là 14 giờ.

Mặt khác, theo tài liệu đã công bố năm 2002 [119], sản phẩm thu được từ phản ứng alkyl hóa của curcumin với tác nhân methyl cloroacetat là dẫn chất dialkyl hóa trên 2 nhóm -OH phenol của curcumin. Tuy nhiên, sản phẩm thu được trong nghiên cứu này là dẫn chất tetraalkyl hóa PH1, PH2. Kết quả này được chứng minh bằng các phương pháp phân tích phổ tại Mục 4.2.1.

4.1.1.2. Về phản ứng thủy phân tạo PH3 và phản ứng tạo muối PH4

Các dẫn chất chứa liên kết ester có thể bị thủy phân trong môi trường acid hoặc kiềm trong đó môi trường kiềm thường dẫn tới phản ứng thủy phân hoàn toàn và cho hiệu suất cao. Thực tế, khi chúng tôi thử nghiệm thủy phân PH1, PH2 trong môi trường NaOH/methanol-nước, kết quả thu được là dẫn chất của natri ferulat

(cấu trúc được thể hiện trên phổ MS, 1H-NMR [Phụ lục 19-21]). Vì vậy, để thu được sản phẩm mong muốn là PH3 chúng tôi lựa chọn môi trường acid và khảo sát chọn ra được dung môi phù hợp là 1,4-dioxan để tiến hành phản ứng thủy phân PH1, PH2.

Đáng chú ý là, nhiệt độ cǜng là yếu tố quan trọng cần chú ý trong phản ứng thủy phân này: ở nhiệt độ thấp phản ứng xảy ra chậm và không hoàn toàn, ngược lại ở nhiệt độ cao lớn hơn 100 °C (nhiệt độ hồi lưu của dung dịch HCl, hoặc của hỗn hợp dioxan/HCl) nhanh chóng xảy ra hiện tượng cắt đứt phân tử tạo dẫn xuất của acid ferulic (quan sát trên SKLM). Để có hiệu quả tốt cho phản ứng này, chúng tôi đã kiểm soát chặt chẽ ở nhiệt độ 85±5 °C (chưa đạt tới nhiệt độ hồi lưu của hỗn hợp dioxan/HCl). Tuy nhiên, do PH1, PH2 vẫn bị phân hủy 1 phần trong môi trường phản ứng (quan sát thấy trên SKLM và NMR của PH3 [Phụ lục 13-18]), nên hiệu suất thu được là chưa cao.

PH3 có 4 nhóm -COOH, đều có thể tạo muối với NaHCO3. Chính vì vậy, phản ứng của chúng được thực hiện với sự kiểm soát tỷ lệ mol là: PH3 : NaHCO3 = 1 : 4 nhằm thu được sản phẩm PH4 với cả 4 vị trí -COONa.

4.1.2. Bàn luận về phản ứng tạo muối dinatri O,OƟ-bis(2-sulfonatoethyl)- curcumin (PH5)

Phản ứng tổng hợp muối xảy ra theo cơ chế thế nucleophil lưỡng phân tử SN2. Trong đó, nhóm OH phenol của curcumin đóng vai trò là tác nhân nucleophil tấn công vào carbon electrophil của RX. Trong phản ứng này, chúng tôi đi từ hai phương pháp: Phương pháp 1: Phản ứng alkyl hóa giữa muối sulfonat và curcumin (phương pháp được trình bày tại phẩn thực nghiệm của luận án) và phương pháp 2: Thực hiện phản ứng Strecker giữa một alkyl halogenid (TG) và muối Na2SO3 theo cơ chế thế nucleophil SN2, xảy ra theo sơ đồ hình 4.1. Với phương pháp này, chất trung gian TG là di-O-(2-cloroethyl)curcumin hoặc di-O-(2- bromoethyl)curcumin được tổng hợp bằng phản ứng alkyl hóa curcumin với tác nhân dibromoethan hoặc dicloroethan, sử dụng kali carbonat làm base trong dung môi aceton; sau đó tiến hành tạo muối TG với Na2SO3.

Hình 4.1. Phản ứng tổng hợp PH5 đi từ dihalogenoethylcurcumin

79 79 79 81

Tuy nhiên, thực tế khi tiến hành phản ứng theo phương pháp 2 này không thu được sản phẩm PH5 mà sẽ tạo thành hỗn hợp sản phẩm phụ (SKLM cho các vết không trùng với vết sản phẩm PH5 do phản ứng cộng của Na2SO3 có khả năng vào một nhóm ceton). Kết hợp với dữ liệu thu được từ phổ MS cho hỗn hợp này, có thể dự đoán các sản phẩm phụ này là 3 chất PH5a, PH5b và PH5c (xem Hình 4.2). Cụ thể như sau, trên phổ đồ xuất hiện cụm 3 pic kề nhau với m/z là 706,32; 708,32; 710,32 có tỉ lệ cường độ tương đối là 1 : 1,95 : 0,95. Điều này chứng tỏ có 2 nguyên tử brom (tỷ lệ của hai đồng vị 79Br và 81Br trong tự nhiên 1:0,98) trong CTPT: C25H26 Br BrNa2O9S (m/z 706,32); C25H26 Br BrNa2O9S (m/z 708,32);

C25H2681Br81BrNa2O9S (m/z 710,32). Bên cạnh đó, trên phổ đồ cǜng xuất hiện cả cụm 2 pic kề nhau ứng với tỷ lệ cường độ tương đối là 1:0,98 phù hợp với hợp chất có 1 nguyên tử brom với m/z lần lượt là 730,46 (CTPT: C25H26 Br Na3O12S2) và 732,46 (CTPT: C25H26 Br Na3O12S2) [Phụ lục 30b].

Hình 4.2. Các khả năng tạo sản phẩm phụ của phản ứng giữa

dihalogenoethylcurcumin và Na2SO3

Như vậy, để thu được PH5, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 1. Điều kiện tiến hành phản ứng alkyl hóa phải khan hoàn toàn để tránh phân hủy curcumin, làm giảm hiệu suất phản ứng. Do đó dung môi phản ứng là aceton và chất hoạt hóa K2CO3 cần được làm khan trước khi thực hiện phản ứng.

Trong hỗn hợp sau phản ứng chỉ có K2CO3 không tan trong MeOH bởi vậy hỗn hợp sản phẩm được tiến hành chiết rắn lỏng với MeOH nóng. Khó khăn gặp phải ở bước tinh chế này là MeOH không hòa tan được hoàn toàn PH5, PH5 đóng bánh với K2CO3 nên một lượng nhỏ PH5 bị mất theo K2CO3, làm giảm hiệu suất phản ứng. Tiếp theo, tiến hành chiết pha nước với ethyl acetat để loại hết curcumin và một phần mono natri O-(2-sulfonatoethyl)curcumin. IPA nóng có khả năng hòa tan chọn lọc tác nhân natri 2-bromoethansulfonat và tạp mono natri O-(2-

sulfonatoethyl)curcumin do vậy tiến hành chiết phần cắn (gồm PH5, mono natri O-(2-sulfonatoethyl)curcumin, natri 2-bromoethansulfonat) với IPA nóng. Tuy nhiên thao tác này chưa loại được hoàn toàn natri 2-bromoethansulfonat, mono natri O-(2-sulfonatoethyl)curcumin bởi sản phẩm và tạp tồn tại ở dạng chất rắn, kết dính với nhau rất chặt chẽ do vậy phần cắn còn lại sau khi nghiền hòa tan bằng lượng nước vừa đủ rồi thêm từ từ IPA nóng vào đến khi thu được lượng tủa nhiều nhất.

4.1.3. Bàn luận về phản ứng tạo dẫn chất hydroxyethyl của curcumin (PH6 và PH7)

Hydroxylethyl hóa curcumin tạo ra hai dẫn chất cải thiện độ tan là PH6 và PH7. Đây cǜng là 2 trung gian để tiếp tục tạo thêm các dẫn chất khác trong luận án. Phản ứng alkyl hóa tạo tạo hai dẫn chất PH6 và PH7 diễn ra theo hai giai đoạn. Ở giai đoạn đầu, curcumin được alkyl hóa tạo thành sản phẩm monoalkyl PH6. Giai đoạn này diễn ra khá nhanh chóng và dễ dàng, chỉ sau 6 giờ phản ứng vết PH6 đã chiếm tỷ lệ khoảng 40 % trên SKLM và hầu như không tăng thêm khi kéo dài thời gian phản ứng (đối với cả 2 tác nhân 2-bromoethanol và 2-cloroethanol). Ở giai đoạn sau, PH6 tiếp tục được alkyl hóa tạo PH7, giai đoạn này diễn ra chậm hơn và khó khăn hơn dẫn đến hiệu suất thấp hơn so với sản phẩm PH6. Cụ thể như sau:

4.1.3.1. Về phản ứng tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH6)

Cấu trúc phân tử curcumin có 2 nhóm OH phenol và nhóm β-diceton, trong đó nhóm β-diceton có nhóm –CH2 linh động và dễ bị hỗ biến tạo OH enol. Chính vì thế, phản ứng alkyl hóa curcumin bằng 2-bromoethanol không chỉ tạo ra sản phẩm mong muốn PH6 mà có thể hình thành các tạp chất alkyl hóa xảy ra trên CH2 linh động, OH enol và nhóm OH phenol còn lại. Các khả năng tạo tạp được minh họa trên Hình 4.3. Khả năng tạo tạp mono tại -OH enol hoặc CH2 linh động (PH6a, PH6b) khó xảy ra hơn so với PH6 là do cặp điện tử trên O của curcumin đã tham gia liên hợp. Thực tế phản ứng cho vết trên sắc ký có vết monoalkyl (PH6) đậm, dialkyl (PH7), xuất hiện vết trialkyl (PH6c, PH6d) nếu kéo dài thời gian phản ứng. Đồng thời vết nguyên liệu vẫn còn sau phản ứng, điều này gây khó khăn khi tách thu sản phẩm PH6 và nâng cao hiệu suất phản ứng. Do đó, cần kiểm soát chặt chẽ các thông số phản ứng bao gồm: tỷ lệ mol tác nhân: nguyên liệu, nhiệt độ, dung môi, xúc tác, nồng độ tác nhân, thời gian phản ứng để thu được PH6 tốt nhất.

Hình 4.3. Các khả năng sản phẩm phụ có thể tạo thành của phản ứng tạo PH6

4.1.3.2. Về phản ứng tổng hợp di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin (PH7)

Phản ứng tạo PH7 đi từ 2-bromoethanol được thực hiện theo tài liệu [33]. Dựa trên SKLM có thể thấy sản phẩm của phản ứng bao gồm mono-O-(2- hydroxyethyl)curcumin và di-O-(2-hydroxyethyl)curcumin giống như tài liệu đã công bố. Phản ứng đạt hiệu suất 49,27 %, cao hơn so với tài liệu (32 %). Chú ý là, dẫn chất PH7 là trung gian để tổng hợp các dẫn chất PH13-PH16, nên được chúng tôi khảo sát một số điều kiện và nâng quy mô lên 5 g/mẻ, tương nhự như PH6. Tác nhân lựa chọn được là 2-bromoethanol. Dung môi là aceton không cần bổ sung DMF, tinh chế bằng cách chiết (không sử dụng sắc ký cột như tài liệu). Phản ứng xảy ra theo cơ chế SN2 (Hình 4.4).

Hình 4.4. Cơ chế phản ứng tổng hợp PH7