Độ Ẩm Dược Liệu: Được Xác Định Bằng Phương Pháp Mất Khối Lượng Do

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Khảo sát đặc điểm thực vật học

3.3.1.1. Khảo sát hình thái

Quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và các bộ phận của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,…

3.3.1.2. Khảo sát vi phẫu rễ

Rễ tươi được cắt bằng tay với dao lam theo phẫu thức ngang.

- Nhuộm vi phẫu bằng phương pháp nhuộm kép với thuốc nhuộm lục iod và son phèn.

- Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính.

3.3.1.3. Khảo sát bột rễ dược liệu

Rễ Đinh lăng được phơi sấy ở nhiệt độ 50 oC đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây để lấy hết.

- Bột rễ Đinh lăng được quan sát trong môi trường nước ở vật kính 10X, 40X.

- Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính.

3.3.2. Thử tinh khiết

Theo các phụ lục trong Dược Điển Việt Nam IV (DĐVN IV)

3.3.2.1. Độ ẩm dược liệu: Được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô bằng cách dùng cân hồng ngoại theo phụ lục 9.6 (trang PL – 182). Độ ẩm không quá 13,0 %.

3.3.2.2. Xác định tro toàn phần: Được tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp 2 (trang PL – 183). Không quá 8,0 %.

Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 oC đến 105 oC rồi đem nung trong lò nung ở 600 oC ± 25 oC. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khôi lượng không đổi.

Các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên được tiến hành thử 3 lần độc lập và lấy giá

trị trung bình.

3.3.3. Nghiên cứu hóa học

3.3.3.1. Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn Chiết xuất

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt

Dược liệu sau khi được làm ẩm bằng dung môi chiết ethanol 96 % , được cho vào bình ngấm kiệt. Sau 24 giờ, rút dịch chiết với tốc độ 1.5 ml/ phút, chiết kiệt đến khi dịch chiết không còn chất, kiểm tra bằng SKLM với thuốc thử H2SO4/EtOH 20 % (không còn vết màu trên bản mỏng).

Gộp tất cả dịch chiết lại, trộn đều, cô thu hồi dung môi trong điều kiện áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 60 oC để đuổi hết ethanol, ta thu được cao toàn phần.

Cao được bảo quản trong chai kín, dán nhãn và bảo quản lạnh.

Điều chế cao phân đoạn

Điều chế cao phân đoạn từ cao toàn phần bằng kỹ thuật lỏng – lỏng

Cao toàn phần được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dịch này lần lượt với các dung môi sau: Diethyl ether, ethyl acetat, n - butanol. Các phân đoạn thu được đem cô dưới áp suất giảm tới cao đặc.

Tóm tắt quy trình chiết xuất và thu cao phân đoạn theo sơ đồ hình 3.1.

Bột dược liệu

Chiết ngấm kiệt/ cồn 96 %

Dịch chiết cồn

Bã dược liệu

Cô quay

Cao cồn

Hòa với nước

Dịch nước

Lắc với diethyl ether

Dịch diethyl ether

Dịch nước

Cô quay Lắc với ethyl acetat

Cao diethyl ether

Dịch ethyl acetat

Dịch nước

Cô quay

Cao ethyl acetat

Lắc với n-butanol

Dịch n-butanol

Dịch nước

Cô quay Cô quay

Cao n-butanol

Cao nước

Hình 3.1. Sơ đồ điều chế các loại cao bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

3.3.3.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn Phương pháp sử dụng DPPH

Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả ổn định. Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu.

Nguyên tắc:

Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm (Viện dược liệu, 2006; Wojdylo A. et al, 2007).

Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử

Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol bằng cách hòa tan 5,915 mg DPPH với một lượng methanol vừa đủ, sau đó cho vào bình định mức và thêm methanol vừa đủ 25 ml. Pha xong dùng ngay, đựng trong chai thủy tinh màu.

Mẫu thử:: Khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các mẫu cao toàn phần, cao diethyl ether, cao ethyl acetat, cao n-butanol, cao nước. Các cao này được hòa tan với MeOH để đạt được nồng độ ban đầu là 1000 μg/ml. Nếu khó tan có thể dùng DMSO trợ tan.

Đối chứng dương được sử dụng là vitamin C.

a) Sàng lọc HTCO của cao phân đoạn bằng SKLM.

Phương pháp hiện màu trực tiếp trên bản mỏng đã chạy sắc ký là phương pháp đơn giản và rẻ tiền nhất, dễ dàng thực hiện và đòi hỏi rất ít các trang thiết bị để phát hiện các thành phần có hoạt tính. Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong việc định vị và xác định đặc tính của chất trong quá trình phân lập chất theo định hướng hoạt tính sinh học, là việc kết hợp chạy SKLM với thử nghiệm sinh học tại chỗ. Nó cho phép định vị vị trí chất có hoạt tính trên bản mỏng trong một hỗn hợp chất nền. Tuy nhiên phương pháp này chỉ có tác dụng chủ yếu là phát hiện ra các chất mới có hoạt tính, thường là các chất dẫn đường cho nghiên cứu tiếp theo (Masoko P. and Eloff J.N., 2007; Wang J. et al, 2012).

Bản mỏng: Silica gel 60 F254.

Dung dịch thử: Lấy 0,1 g cao hòa tan với 2 ml MeOH.

Dung môi khai triển:n-butanol - acid acetic - nước (7:1:2).

Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365 nm. Sau đó bản mỏng sẽ được nhúng với TT DPPH /MeOH trong 5 giây. Sau khi nhúng 2

phút những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa sẽ hiện màu vàng sáng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxy hóa làm mất màu tím của TT. DPPH.

Đồng thời triển khai thêm 1 bản mỏng cùng điều kiện và mỗi bản mỏng sau khi khai triển được nhúng vào TT. FeCl3 5% /cồn.

Chứng dương sử dụng là vitamin C.

So sánh bằng mắt thường giúp ta định hướng được những phân đoạn và vết chất nào nào có thể hiện hoạt tính chống oxy hóa.

b) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng quang phổ UV – Vis Phương pháp này giúp khẳng định chính xác hơn về hoạt tính chống oxy hóa của

các cao phân đoạn dựa trên HTCO của các cao phân đoạn (Nguyễn Thượng Dong và

cs, 2006):

Tiến hành quy trình khảo sát

Bảng 3.1. Phản ứng thử nghiệm sử dụng DPPH

Ống

Dung dịch thử (ml)	Dung dịch MeOH (ml)	Dung dịch DPPH (ml)
Trắng	0	4	0
Chứng	0	3,5	0,5
Thử	0,5	3	0,5