Thử Nghiệm Đánh Giá Khả Năng Kết Hợp Với Ion Sắt Ii

2.2.4.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II

Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với thuốc thử Ferrozin (Viện dược liệu, 2006).

EDTA được sử dụng như chất đối chiếu dương tính. Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)]x100

2.2.4.5. Thử nghiệm đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd

Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử, sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím (Viện dược liệu, 2006 ; Wang J, 2007).

Enzym superoxyd dismutase (SOD) được sử dụng như chất đối chiếu dương tính.

HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ (ODchứng – ODtrắng)] x 100

2.2.4.6 Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Phương pháp

FRAP)

Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power) được thực hiện

đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử hóa của các chất trong huyết tương, nhưng đây cũng là phương pháp được sử dụng để thử nghiệm các chất chống oxy hóa trong thực vật. Phương pháp này dựa vào sự khử phức ferric 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe3+ – TPTZ) thành phức chất ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe2+ – TPTZ) bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxy hóa) ở pH thấp. Phức Fe2+ – TPTZ tạo thành có màu xanh dương đậm, bền vững và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 593 nm ( Benzie I.F.F and Strain J.J, 1999 ; Wojdylo A. et al, 2007 ; Nguyen Thi Hoai Thu et al, 2011)

N

N N

N N N

Fe3+

N N N

N N

N

antioxidant +e

N N N N N N Fe2+ N N N N N N

Có thể bạn quan tâm!

• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms trồng tại An Giang - 2
• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms trồng tại An Giang - 3
• Tác Động Của Gốc Tự Do Và Sự Liên Quan Đến Bệnh Tật Con Người
• Độ Ẩm Dược Liệu: Được Xác Định Bằng Phương Pháp Mất Khối Lượng Do Làm Khô Bằng Cách Dùng Cân Hồng Ngoại Theo Phụ Lục 9.6 (Trang Pl – 182).
• Chiết Xuất Và Điều Chế Cao Phân Đoạn
• Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của rễ cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms trồng tại An Giang - 8

Xem toàn bộ 78 trang tài liệu này.

Hình 2.6. Phản ứng FRAP

2.2.4.7. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 (Hydrogen peroxide scavenging activity)

Hai tiểu phân O2- và H2O2 sinh ra từ chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra 1O2, .OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzym peroxydase từ cải gia (Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý, 2006)

2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây. Nhưng các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng- lỏng và chiết rắn- lỏng.

- Chiết lỏng – lỏng (phân bố lỏng– lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố.

- Chiết rắn – lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010).

2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt

các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan các hợp chất có tính phân cực mạnh.

Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K.

K Ca

Cb

Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng.

Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó.

Nhược điểm: Do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2. Kỹ Thuật chiết rắn – lỏng

Trong thực ngiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhều, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự chiết bằng máy chiết Soxhlet, sự chiết bằng cách nấu nguyên liệu với nước còn được gọi là nước sắc. Ngoài ra còn có sự chiết với các phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn,… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt.

Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn.

Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn.

Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v… có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết.

Có 3 phương pháp ngấm kiệt:

- Ngấm kiệt thường.

- Ngấm kiệt kèm sấy phun.

- Ngấm kiệt ngược dòng.

Ngấm kiệt thường là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp.

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi thời điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong Dược liệu.

Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v… có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Phương pháp ngâm lạnh

Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. Trong thời gian này, cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Phương pháp ngâm nóng

Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi.

Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn.

Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước. Chưng cũng có thể coi là một biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2.3. Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa

Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn.

Túi đựng bột dược liệu của kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt hơn.

Ưu điểm: Lượng dung môi sử dụng nhỏ mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt

chất.

Nhược điểm: Khó thực hiện cho một lượng lớn Dược liệu. Thông thường, chỉ

dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot.

Không khấy trộn được trong quá trình chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng,

2007).

2.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước.

Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính bay hơi

được, ví dụ như tinh dầu.

Dụng cụ: Có thể tự lắp ráp hệ thống lôi cuốn hơi nước theo kiểu cổ điển với nhứng dụng cụ thủy tinh sẵn có trong phòng thí nghiệm (bình cầu, bếp đun, ống ngưng hơi, các ống nối bằng thủy tinh,…) hoặc theo kiểu cải tiến Dean – Start (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2.5. Chiết các nguyên liệu tươi

Với các mô sống của động vật hay các dược liệu mỏng manh như lá, hoa người ta có thể chiết nhanh các chất trong tế bào với các dung môi nước hoặc thân nước bằng cách xay nhỏ mô động thực vật trong dung môi.

Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) trong một thời gian ngắn khoảng 5 - 10 phút. Với tốc dộ này, các mô được phân tán rất nhỏ, tế bào bị

vỡ và các chất tan đi thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu bằng quá trình hòa tan. Sự thẩm thấu, nếu có cũng chỉ đóng vai trò thứ yếu.

Với cách chiết này, toàn bộ các chất trong tế bào gồm cả các chất chuyển hóa bậc II lẫn các chất đại phân tử đều có mặt trong dịch chiết. Cách chiết này có lợi khi nghiên cứu các protein, các chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ các của phân tử. Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động của các enzym có thể làm thay đổi cấu trúc các chất và hạn chế các tạp chất như protein, polysaccharid, dung môi sử dụng có thể là cồn hay aceton.

Quá trình chiết này do được thực hiện bằng máy khuấy có tốc độ cao nên cũng được gọi là turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.2.6. Các phương pháp chiết khác

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.3. Một số phương pháp phân lập hợp chất hữu cơ

2.3.3.1. Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silica gel nhôm oxyt) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất béo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010).

Các ứng dụng của SKLM (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010):

- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được.

- So sánh với một chất chuẩn.

- Kiểm nghiệm dược liệu.

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu.

- Xác định sự có mặt của một dược liệu nào đó trong hỗn hợp.

- Xác định một hợp chất là thành phần của một hỗn hợp

- Theo dòi phản ứng, tối ưu hóa phản ứng.

- Bán định lượng.

- Đối với bản mỏng chế hóa, có thể phân lập và thu được hợp chất tinh khiết.

2.3.3.2. Sắc kí cột

SKC nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lượng lớn từ một hỗn hợp nhiều thành phần (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010).

Sắc kí cột cổ điển

Nguyên tắc: Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxyt). Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010).

Một vài SKC cải tiến

Sắc kí cột khô:Kỹ thuật này tương đồng với kỹ thuật SKLM điều chế.

Sắc kí cột chớp nhoáng (FC): Đây là kỹ thuật sắc kí lỏng dùng áp suất nén ở đầu cột. Có thể tách chất nhanh trong 10 – 15 phút một hỗn hợp mẫu chất ( từ 10 mg – 10

g) chứa những hợp chất mà SKLM cho các vết ΔRf ≥ 0.15.

Sắc kí cột chân không (VLC): VLC là một dạng SKC nhanh không tiêu chuẩn, là một dạng sắc kí hấp phụ trên cột pha thuận khai triển với tốc độ nhanh. Về khả năng tách, VLC đạt khả năng tách trung bình (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.3.3. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là kỹ thuật sắc kí với các ưu điểm: Tốc độ cao, độ phân giải cao, độ nhạy cao, cột có thể tái sử dụng, không phá hủy các thành phần, các thiết bị được tự động (máy vi tính), mẫu được phục hồi hoàn toàn, việc đinh lượng dễ dàng và nhanh,…

HPLC có thể chia thành 2 loại chính theo mục đích sử dụng: Loại sắc kí phân tích và loại sắc kí điều chế hoặc bán điều chế.

Hệ thống HPLC gồm: Bình chứa dung môi ( pha động), bơm áp lực cao, thiết bị đầu vào mẫu, cột, đầu dò, bộ phận ghi nhận (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Đinh lăng được thu hái ngày 11/2016 tại Tri tôn – An giang, dược liệu thu hái về được nhận dạng bởi PGS.TS.Trần Công Luận và so sánh với các mô tả trong tài liệu tham khảo (Đỗ Tất Lợi, 2004 và Vò Văn Chi, 2004), là đúng loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa(L.) Harms).

Lá, hoa, quả, rễ tươi được rửa sạch và khảo sát hình thái.

Rễ tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng, sau đó thái lát mỏng và đem sấy ở 50 oC (bằng tủ sấy). Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu.

Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn Dược liêu, trường Đại Học Tây Đô.

3.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

3.2.1. Dung môi, hóa chất

Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản sẵn có trong phòng thí nghiệm, trong phần thực nghiệm có sử dụng:

- Chất đối chứng: Vitamin C (Ấn Độ).

- Chất DPPH ( Anh)

- Dung môi chiết xuất: cồn 96 %.

- Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat,

n-butanol, methanol, cloroform, acid acetic, n-hexan,...

- SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm Merck (Đức).

- Silica gel cỡ hạt 37 – 63 μm (Ấn Độ).

- Thuốc thử vanillin sufuric (VS), thuốc thử H2SO4 10%, FeCl3 5%...

3.2.2. Thiết bị, dụng cụ

- Máy đo quang phổ UV – 1800 SHIMADZU (Nhật Bản)

- Đèn soi UV-Vis Desaga Sarstedt Gruppe. (USA)

- Cân hồng ngoại, cân phân tích, cân kỹ thuật OHAUS (Trung Quốc).

- Máy cô quay (Trung Quốc).

- Bếp cách thủy (Trung Quốc).

- Máy xay nguyên liệu, máy lắc phân bố (Trung Quốc).

- Bình ngấm kiệt, bình hút ẩm (Việt Nam).

- Tủ sấy Shanghai Fengling (Trung Quốc).

- Cột sắc kí.

- Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm.