Mức Độ Ảnh Hưởng Của Thuốc Trừ Sâu Lên Một Số Loài Thủy Sản Ở

Theo danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở Việt Nam (2010) thì hoạt chất quinalphos có nhiều tên thương mại khác nhau của các công ty trong và ngoài nước như DDVQuin 25EC, Faifos (5G, 25EC), Kinalux 25EC, Methink 25 EC, Peryphos 25 EC, Quiafos 25EC, Quilux 25EC, Quintox (5EC, 10EC, 25 EC).

Hoạt chất quinalphos có tỷ trọng 1,235 g/mL ở 200C lớn hơn tỷ trọng của nước, hòa tan được trong các dung môi như hexane tuloene, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol; ổn định trong axít, kiềm ... (Biotech, 1991).

2.6 Mức độ ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên một số loài thủy sản ở

nồng độ gây chết (LC50–96 giờ)

Hiện nay một số thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ đã được nghiên cứu xác định nồng độ gây chết LC50 trên nhiều đối tượng thủy sản và giá trị tương đối khác nhau ở nhiều loài. Theo Murty et al. (1984) nghiên cứu về độc chất của methyl parathion và fensulfothion (là hai loại hoạt chất có cùng nhóm phenyl organothiophosphate) trên cá Mystus cavasius thì thấy giá trị LC50–96 giờ của hai hoạt chất này lần lượt là 5,9 mg/L và 16,5 mg/L, trên cùng một đối tượng hoạt chất methyl parathion có giá trị LC50–96 giờ thấp hơn chứng tỏ rằng độ độc của thuốc cao hơn nhiều so với hoạt chất fensulfothion. Tương tự ở cá Mystus cavasius giá trị LC50–96 giờ sau khi cho tiếp xúc với hoạt chất fenitrothion là 3,3 mg/L (Murty et al., 1982). Ngoài ra, ảnh hưởng của hoạt chất thuốc trừ sâu lên cá cũng khác nhau theo kích cỡ, đối với loài cá Labeo rohita thì LC50–96 giờ được nghiên cứu ở các kích cỡ khác nhau khi tiếp súc với hoạt chất fenitrothion thì có giá trị tương ứng là 3 đến 4,4 cm là 2,8 mg/L; 4,5 đến 5,9 cm là 4,1 mg/L và 6 đến 8 cm là 4,6 mg/L. Tuy nhiên, các giá trị này khác biệt không có ý nghĩa (Murty et al., 1982). Ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) nồng độ gây chết 50% sau 96 giờ khi tiếp xúc với diazinon là 390 µg/L, nồng độ tương đối thối thấp này chứng tỏ rằng hoạt chất rất độc với tôm (Ngô Thanh Toàn, 2008).

Ở một số loài cá rô phi các giá trị LC50 của các loại thuốc trừ sâu cũng tương đối khác nhau tùy theo từng hoạt chất. Ở cá rô phi đỏ (Oreochromis spp.) khi thí nghiệm được bố trí ở 6 mức nồng độ diazinon khác nhau, giá trị

LC50 của cá ở 96 giờ được xác định là 3,84 mg/L (Palacio, 2002). Theo Pathiratne (1999) ngưỡng gây chết 50% cá rô phi (Oreochromis mossambicus) khi tiếp xúc với hoạt chất fenthion thời gian 96 giờ có giá trị 0,83 mg/L ở cá có khối lượng từ 0,19 g đến 0,26 g và 2,07 mg/L ở khối lượng 1,2 g đến 2,9 g. Trong một nghiên cứu khác giá trị LC50–96 giờ trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) có khối lượng 14,3±1,3 g được thí nghiệm trên hoạt chất lidane là 3,16 mg/L (Hmoud, 1996) trong khi đó cá có khối lượng 4 cm đến 6 cm khi tiếp xúc hoạt chất deltamethrin có giá trị là 15,5 mg/L (Josephine et al., 2006). Tuy nhiên, ngưỡng gây chết 50% ở 48 giờ ở cá rô phi (Oreochromis niloticus) khi cho tiếp xúc với deltamethrin có giá trị tương đối thấp đối với ấu trùng và cá con lần lượt là 1,17 µ/L và 1,7 µ/L (Caglan et al., 2009) cho thấy cá nhỏ dễ bị ảnh hưởng của thuốc hơn cá lớn.

Hoạt chất quinalphos cũng được nghiên cứu xác định ngưỡng gây chết trên loài cá Channa punctatus, nồng độ gây chết LC50-96 giờ có giá trị là 0,25 mg/L (Sastry and Abad, 1982). Trong khi đó ở cá chép (cyprinus carpio) có kích cỡ 2±0,2 g giá trị LC50-96 giờ là 7,5 µg/L (Chebbi and David, 2009).

2.7 Ảnh hưởng của thuốc BVTV lên một số men ở cá

2.7.1 Sơ lược về men cholinesterase

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 61 trang tài liệu này.

Cholinesterase tập trung nhiều ở các mô thần kinh, não, huyết tương và hồng cầu của động vật có xương sống. ChE có hai loại gồm: acetylcholinesterase (AChE) và khi men này bị ức chế cao chúng sẽ làm chết các loài sinh vật; loại thứ hai là butyrylcholinesterase (BChE) khi bị ức chế nhiều vẫn không khả năng làm chết sinh vật (Fulton và Key, 2001). Đặc biệt, các cholinesterase rất nhạy cảm với các loại thuốc trừ sâu oraganophosphorus và carbamate (Ralph et al., 1994).

AChE rất quan trọng trong việc điều tiết, dẫn truyền xung thần kinh ở các synapse của hệ thống thần kinh. Vì vậy, AChE có khả năng quyết định chức năng của hệ thống thần kinh và dễ dàng bị ảnh hưởng bởi các thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và carbamate kể cả động vật sống dưới nước và động vật sống trên cạn, sự ức chế của AChE đã được sử dụng như một chất đánh dấu sinh học. Tuy nhiên, sử dụng sự ức chế AChE làm chất đánh dấu sinh học ở động vật không xương sống vẫn chưa được nghiên cứu sâu (Fulton and Key, 2001).

2.7.2 Khả năng ức chế men cholinesterase (ChE) của thuốc BVTV

Sự ức chế của men cholinesterase đã được nghiên cứu rất nhiều ở người và các loài động vật qua việc tiếp xúc với các chất độc, đặc biệt là các loại

thuốc BVTV.

Theo Addison (1992) men cholinesterase có thể bị ức chế do liên kết được với nhiều hóa chất khác bao gồm những loại thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc carbamate. Sự ức chế ChE ở cá đã được sử dụng tới việc đánh giá tác động các loại thuốc trừ sâu trong môi trường nước. Nghiên cứu trên loài cá Gambusia ajfini tác giả Boone và Janice (1996) cho rằng, ChE ở não và thịt của cá bị ức chế cao trong suốt 48 giờ khi cá tiếp xúc với các hoạt chất chlorpyrifos (0,1 ppm), parathion (0,15 ppm) và methyl parathion (8 ppm). Vùng não của cá bị ức chế cao nhất ở thời điểm 12 giờ sau khi tiếp xúc với parathion và chlorpyrifos và 4 giờ sau khi tiếp xúc với methyl parathion, tất cả thuốc điều ức chế ChE hơn 70% ở thời điểm 4 giờ trong thịt. Ở cá rô đồng giống mức độ nhạy cảm của ChE với hai hoạt chất diazinon và fenobucarb cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy diazinon độc hơn fenobucarb, nồng độ 0,05 mg/L của diazinon đã ức chế 73% ChE. Tất cả cá chết điều có hoạt tính của ChE bị ức chế lớn hơn 70% so với mức bình thường (Nguyễn Văn Công và ctv., 2008a).

2.7.3 Ảnh hưởng của thuốc BVTV lên men Glutathione S-transferase (GST)

GST là men có vai trò trong việc giải độc, có chức năng xúc tác các phản ứng giữa hợp chất có ái lực điện tử như thuốc trừ sâu, kim loại nặng,… với glutathione (GSH), các hợp chất từ đó chuyển thành N-acetyl cystine S dạng kết hợp sau đó sẽ thải qua nước tiểu và phân (Yawad, 1989 trích bởi Nguyễn Ngọc Hiền, 2008).

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trừ nấm lên men GST trên cá hồi (Salmo trutta) thì Almli et al. (2002) cho rằng hoạt chất của thuốc trừ nấm làm giảm dáng kể hoạt tính của GST ở mang cá trong khi ở gan thì có sự thay đổi không đáng kể trong thời gian 5 ngày đầu. Tuy nhiên khi cho tiếp xúc với thuốc thêm 4 ngày nữa thì hoạt tính GST trong gan tăng lên rò rệt. Ở cá Corydoras paleatu khi tiếp xúc với hoạt chất lindane ở nồng độ 6 µg/L thì hoạt tính của GST thay đổi không đáng kể, nhưng men này thay đổi ở mức nồng độ 25 µg/L (Silvia et al., 2008). Theo nghiên cứu của Kathya và Martinez (2010) thì hoạt tính men GST tăng lên đáng kể ở gan cá Prochilodus lineatus trong thời gian từ 24 giờ đến 96 giờ đầu tiếp xúc với thuốc trừ cỏ có hoạt chất glyphosate. Qua các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính men GST ở gan có xu hướng tăng lên nhằm thực hiện chức năng giải độc cho cở thể khi tiếp xúc với môi trường bị nhiễm độc.

2.8 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của cá rô phi

Khi cá tiếp xúc với thuốc trừ sâu ở mức dưới ngưỡng gây chết cơ thể cá điều bị ảnh hưởng ở những mức độ khác nhau theo nồng độ và hoạt chất của thuốc. Theo Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Anh Tuấn (2009) thì cá tiếp xúc với các mức nồng độ thuốc khác nhau dưới ngưỡng gây chết khi đó cá sẽ tăng cường hô hấp thông qua việc hấp thu oxy vào máu và qua đó độc tố của thuốc cũng được hấp thu vào cơ thể nhiều hơn. Ở cá lóc không ảnh hưởng đáng kể đến tỉ lệ nở và tỉ lệ dị hình khi tiếp xúc với hoạt chất diazinon nhưng ức chế khả năng tiêu hoá noãn hoàng của cá sau khi nở. Nồng độ ≥0,6 mg/L, diazinon đã làm thời gian tiêu hoá noãn hoàng lâu hơn và ức chế hoàn toàn khả năng tiêu hoá noãn hoàng của cá khi nồng độ ≥19,2 mg/L; nồng độ ≥2,4 mg/L làm giảm kích cỡ cá sau khi hết noãn hoàng (Nguyễn Văn Công và ctv., 2008b).

Ở cá rô phi (Oreochromis niloticus) khi tiếp xúc với hoạt chất gammalin và actellic ở cùng các nồng độ thuốc 0,125; 0,25; 0,50 và 1,0 µg/L thì sau 10 tuần tốc độ tăng trưởng của cá lần lượt là 5,8; 2,4; 1,4 và l,3 g thí nghiệm với gammalin trong khi đó thí nghiệm với actellic thì 6,5; 3,9; 2,4 và 1,8 g (Ufodike et al., 1991). Những nghiên cứu này cho thấy rằng tốc độ tăng trưởng ảnh hưởng bởi nồng độ thuốc, tốc độ tăng trưởng của cá giảm khi nồng độ thuốc tiếp xúc càng cao và ngược lại. Ở cá lóc hoạt chất diazinon đã ức chế tốc độ sinh trưởng tương đối của cá (Nguyễn Văn Công và ctv., 2006). Ngoài ra đối với cá mè vinh, cá chép và cá rô phi khi cho tiếp xúc với thuốc Basudin tỷ lệ sống của cá giảm dần theo sự gia tăng các nồng độ thuốc, sinh trưởng tương đối của cá trong 10 ngày đầu giảm ở nồng độ LC50–96 giờ (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999). Nhìn chung, sự giảm tăng trưởng của cá có thể do nhiều nguyên nhân gây nên, trong đó có sự ảnh hưởng của thuốc lên khả năng bắt mồi của cá.

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 2/2010 đến tháng 9/2010.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Cá dùng trong thí nghiệm

Cá rô phi có kích cỡ 10-12 g/con được mua từ trại sản xuất giống tại thành phố Cần Thơ. Cá mua về được thuần dưỡng trong bể có thể tích lớn khoảng 7 ngày để cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể trước khi bố trí thí nghiệm. Trong thời gian thuần hóa cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn viên công nghiệp. Cá chọn bố trí thí nghiệm có kích cỡ đồng đều, khỏe và hoạt động mạnh.

3.2.2 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

a) Thuốc trừ sâu: thuốc trừ sâu sử dụng là thuốc gốc lân hữu cơ có tên thương mại là Kinalux 25EC (hoạt chất quinalphos) và có nồng độ hoạt chất là 250 g/L do Công ty cổ phần BVTV An Giang sản xuất. Thuốc trừ được nhiều loài sâu hại như sâu phao đục bẹ, nhện gié, sâu cuốn lá trên lúa...

Phương pháp pha nồng độ thuốc: thuốc được pha thành 2 bước, bước 1 pha dung dịch thuốc mẹ từ thuốc ban đầu và bước 2 là pha nồng độ thuốc cho các bể thí nghiệm. Cả 2 dung dịch pha (dung dịch mẹ và dung dịch thí nghiệm) đều dựa vào công thức tính nồng độ sau: C1xV1=C2xV2

Trong đó:

C1 là nồng độ thuốc dung dịch mẹ

V1 là thể tích dung dịch mẹ cần cho vào bể thí nghiệm C2 là nồng độ thuốc cần cho thí nghiệm

V2 là thể tích dung dịch thuốc trong thí nghiệm

b) Các loại hóa chất dùng trong phân tích men cholinesterase: Hóa chất dùng nghiền mẫu, phân tích protein và men ChE gồm:

 KH2PO4, K2HPO4 dùng để pha phosphate buffer pH 7,5.

 Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.2H2O dùng để pha dung dịch sodium phosphate pH 7,4.

 5,5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid, Acetylthiocholine iodine.

 Aceton dùng để rữa dụng cụ trong phân tích mẫu tiếp theo.

 NaOH, Na2CO3, CuSO4.5H2O, NaK Tartrate, Folin, BSA, nước cất…

c) Các loại hóa chất dùng trong phân tích GST: CDNB 50 mM (50,5 mg/5mL ethanol); GSH 50 mM (76,83 mg/5mL dung dịch HEPES, pH = 7,5); dung dịch đệm HEPES 50 mM, pH = 7,5.

d) Các loại hóa chất phân tích các yếu tố môi trường nước.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp xác định LC50 của quinalphos

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nước tĩnh (APHA, 2001) và không thay nước trong thời gian 96 giờ. Thí nghiệm được tiến hành qua hai bước.

Bước 1: thí nghiệm xác định khoảng gây độc (thí nghiệm thăm dò)

Thí nghiệm được tiến hành trong bể kính 60 lít có thể tích nước là 50 lít. Mỗi bể thả 10 cá với kích cỡ là 10-12 g/con. Thí nghiệm được tiến hành với 11 nồng độ thuốc gồm 0,6; 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95; 1,0; 1,05; 1,1;

1,2 mg/L và 1 nghiệm thức đối chứng (không có thuốc).

Cá chết được ghi nhận vào các thời điểm 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ và cá chết được bắt ra để hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng nước.

Thí nghiệm này nhằm xác định được nồng độ thuốc cao nhất gây chết không quá 10% cá sau 96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá sau 1-2 giờ. Khoảng nồng độ này là cơ sở cho bố trí thí nghiệm xác định LC50.

Bước 2: thí nghiệm xác định giá trị LC50

Thí nghiệm này được thực hiện dựa vào kết quả của thí nghiệm thăm dò. Thí nghiệm tiến hành với 11 nồng độ là 0,5; 0,55; 0,6; 0,65; 0,7; 0,75; 0,8;

0,85; 0,9; 1,0; 1,1 mg/L và 1 nghiệm thức đối chứng (không có thuốc). Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí trong bể kính hình chữ nhật chứa 50 L dung dịch. Mỗi bể thả 10 cá, cá được thả vào bể 2 ngày trước khi cho thuốc vào. Trong thời gian thí nghiệm bể không sục khí và không thay nước.

Hình 3.1: Hệ thống thí nghiệm LC50

Theo dòi và ghi nhận số cá chết sau 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ thí nghiệm. Khi phát hiện cá chết được bắt ra để hạn chế ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Nhiệt độ, pH, DO được đo hàng ngày vào lúc 8 giờ sáng và 14 giờ chiều.

Giá trị LC50 được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971).

3.3.2 Xác định ngưỡng ức chế ChE gây chết cá

Thí nghiệm được bố trí ở bốn mức nồng độ quinalphos gồm 0,08 mg/L (10% LC50–96 giờ); 0,42 mg/L (50% LC50–96 giờ); 0,63 mg/L (75% LC50–96

giờ); 0,84mg/L (100% LC50–96 giờ) và nghiệm thức đối chứng (không có

thuốc). Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi bể được bố trí 5 con cá (10–12 g/con) khỏe mạnh và trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm cá không được cho ăn và không thay nước. Khi cá bắt đầu chết thì tiến hành thu mẫu, sau 96 giờ thu toàn bộ cá thí nghiệm còn lại đem phân tích.

Theo dòi thường xuyên và ghi nhận lại các hoạt động, biểu hiện của cá. Khi cá bắt đầu chết thì cho cá vào thùng chứa nước đá và cùng lúc đó cũng thu một con cá ở nghiệm thức đối chứng. Số cá chết ở từng nghiệm thức được đo ChE trong não và thịt.

3.3.3 Xác định mức độ nhạy cảm của ChE và GST với quinalphos

Thí nghiệm được thực hiện ở ba mức nồng độ quinalphos gồm 0,08 mg/L (10% LC50–96 giờ); 0,42 mg/L (50% LC50–96 giờ); 0,63 mg/L (75%

LC50–96 giờ) và nghiệm thức đối chứng (không có thuốc). Thí nghiệm được

bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bể kính 60 lít (chứa 50 lít dung dịch thuốc) và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Mật độ cá thí nghiệm là 25 con/bể. Trong thời gian thí nghiệm 96 giờ không thay nước, không cho ăn nhưng có sục khí

nhẹ để đảm bảo đủ oxy cho cá.

Sau khi đã bố trí thí nghiệm tiến hành theo dòi và thu cá (thu não và gan cá) ở các thời điểm 3, 6, 9, 12, 24, 48 và 96 giờ. Dùng vợt thu nhẹ mỗi bể 3 cá và giết chết ngay bằng nước đá sau đó lấy não và gan để đo hoạt tính của ChE và GST.

3.3.4 Xác định ảnh hưởng của quinalphos lên sự tăng trưởng, tỷ lệ sống của cá

Thí nghiệm bố trí ở bốn mức nồng độ của quinalphos là 0,08 mg/L (10% LC50–96 giờ); 0,17 mg/L (20% LC50–96 giờ); 0,34 mg/L (40% LC50–96

giờ); 0,50 mg/L (60% LC50–96 giờ) và nghiệm thức đối chứng (không có

thuốc). Thí nghiệm được bố trí trong bể nhựa 120 lít với mật độ cá thí nghiệm là 25 con/bể. Cá cho vào bể thí nghiệm 2 ngày để ổn định sinh lý và thích nghi với điều kiện thí nghiệm trước khi cho thuốc vào. Trong thời gian thí nghiệm bể có sục khí và cho cá ăn thức ăn viên công nghiệp Aquafeed (25% đạm), cho cá ăn thoả mãn theo nhu cầu, thức ăn thừa được vớt ra và ghi nhận lại hàng ngày để tính hệ số. Trong thời gian thí nghiệm thay nước 30% mỗi 3 ngày. Tuy nhiên, thay nước chỉ bắt đầu vào ngày thứ 3 sau khi cho thuốc vào.

Thuốc được cho 2 lần trong thời gian thí nghiệm, lần thứ nhất cho vào đầu thí nghiệm và lần thứ hai cho vào sau khi kiểm tra tăng trọng của cá vào ngày thứ 21. Sau lần cho thuốc thứ 2 thì kiểm tra tăng trọng của cá vào ngày 42 và 54 kể từ khi bắt đầu thí nghiệm.

Theo dòi các hoạt động hàng ngày ở các bể thí nghiệm. Ghi nhận số lượng và thời gian cá chết, cá chết sẽ được lấy ra để tránh làm ảnh hưởng đến môi trường nước trong bể thí nghiệm. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, DO đo ngày 2 lần/tuần và NO2-, NO3- và NH3 đo định kỳ 10 ngày/lần và đo trước khi cho thuốc vào bể.

3.4 Phương pháp phân tích

3.4.1 Cách lấy mẫu

Khối lượng cá được cân bằng cân điện tử có độ chính xác 0,001g (Sartorius, Germany), đo chiều dài tổng bằng thước, chiều dài tổng được tính từ mòm đến chót đuôi. Não được lấy từ đầu cá, chuyển sang đĩa petri sạch và lạnh, máu cá đọng trên não được tách ra bằng cách lăn trên giấy thấm, não được chứa trong eppendoft 1,5 ml. Cơ và gan cá cũng được đựng trong eppendoft 1,5 ml, trữ lạnh ở -800C cho đến khi phân tích.