Hình 3.2: Lấy mẫu não cá Hình 3.3: Lấy mẫu cơ cá
3.4.2 Cách nghiền mẫu
Trước khi phân tích hoạt tính men thì các mẫu não, cơ và gan cá được giải đông và được nghiền bằng máy nghiền mẫu. Chuyển mẫu não, cơ và gan cá vào ống thủy tinh sạch chứa dung dịch đệm KH2PO4/K2HPO4 có pH =7,5. Nghiền mẫu cá trong điều kiện lạnh, sau khi nghiền xong chuyển mẫu sang eppendoft 1,5 ml để tiến hành ly tâm lạnh. Ly tâm lạnh mẫu đã nghiền trong điều kiện 40C, vận tốc 10.000 vòng trong 10 phút. Hút lấy phần dịch trong trữ trong ống eppendoft 0,5 ml ở -800C cho đến khi phân tích hoạt tính các men và protein.
3.4.3 Phân tích ChE
Nguyên tắc: ChE được phân tích theo phương pháp Ellman et al. (1961).
Trong quá trình phân tích sử dụng acetylthiocholine iodine (ATChI) như là cơ chất của ChE, ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi ChE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường độ màu đậm dần theo thời gian và hoạt tính của ChE được đo bằng máy so màu quang phổ.
Phương trình phản ứng minh họa: Acetylthiocholine iodine thiocholine + acetate
ChE
Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate
Chuẩn bị hóa chất:
sản phẩm có màu vàng
Dithiobisnitrobenzoate (DTNB, Sigma) 167 µM: 66,1 mg/ml Sodium phosphate 50 mM, pH = 7,4.
Sodium phosphate: nồng độ 50 mM, pH = 7,4.
Cơ chất Acetylthiocholine iodine (ATChI, Sigma) 30mM: 8,67 mg/ml Sodium phosphate, pH = 7,5.
Quá trình phân tích ChE:
Bảng 3.1: Quá trình phân tích ChE
Mẫu trắng (µL) | Mẫu (µL) | |
DTNB (nồng độ cuối 150µM) | 900 | 900 |
Sodium phosphate | 50 | / |
Mẫu | / | 50 |
Cơ chất (nồng độ cuối 1,5mM) | 50 | 50 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và tăng trưởng của cá rô phi (oreochromis niloticus) - 1 -
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và tăng trưởng của cá rô phi (oreochromis niloticus) - 2 -
Mức Độ Ảnh Hưởng Của Thuốc Trừ Sâu Lên Một Số Loài Thủy Sản Ở -
Mức Độ Nhạy Cảm Của Men Che Và Gst Ở Cá Khi Tiếp Xúc Với Hoạt Chất Quinalphos -
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và tăng trưởng của cá rô phi (oreochromis niloticus) - 6 -
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và tăng trưởng của cá rô phi (oreochromis niloticus) - 7
Xem toàn bộ 61 trang tài liệu này.
Đọc ở bước sóng 412 nm trong 10 phút
acetat.
Công thức tính hoạt tính men ChE:
R= Abs * độ pha loãng/ thể tích mẫu (ml) * 0,0136)/protein (mg/mL)
Trong đó:
Đơn vị của R là nmole/min/mg protein.
0,0136: hệ số acetylthiocholine iodine chuyển thành thiocholine và
Công thức tính hoạt tính ChE theo đơn vị phần trăm: R (%) = 100*A/Ao
Trong đó:
- R (%): phần trăm ChE so với đối chứng
- A là hoạt tính ChE ở nghiệm thức có thuốc
- Ao là hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng
Tỷ lệ men ChE bị ức chế tính theo công thức sau:
Trong đó:
- T (%) là tỷ lệ phần trăm bị ức chế so với đối chứng
- A là hoạt tính ChE ở nghiệm thức có thuốc
- Ao là hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng
3.4.4 Phân tích GST
GST được xác định theo phương pháp Habig et al., (1974) có bổ sung. Chất 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) là một hợp chất có tính kỵ
nước được sử dụng để đo hoạt chất của GST. CDNB có ái lực với enzyme phân tích hơn các cơ chất khác và cũng là cơ chất chuyển hóa của nhiều enzyme đồng đẳng với hoạt chất của GST. Ngoài ra, glutathione (GSH) cũng là đồng cơ chất trong phản ứng. Phản ứng thực hiện theo phương trình sau:
CDNB + GSH → CDNB–GSH + HCl
Hoạt tính của GST được đo bằng máy so màu quang phổ thông qua độ
hấp thụ của cơ chất CDNB-GSH ở bước sóng 340 nm trong 3 phút.
Hoạt tính của GST = (A340/phút – Ablank) x độ pha loãng x coff.Exmol CDNBcoeff = 9,6 nM-1cm-1
(hệ số CDNB chuyển thành CDNB-GSH + HCl dưới tác dụng của
GST)
Đơn vị của GST là nmol CDNB/min/mg protein
Quá trình phân tích:
Bảng 3.2: Quá trình phân tích GST
Hoá chất | Mẫu Blank (µL) | Mẫu (µL) | |||
1 | HEPES buffer | 700 | 700 | ||
2 | CNDB | 30 | 30 | ||
3 | H2O | 240 | 200 | ||
4 | GSH | 30 | 30 | ||
5 | Mẫu | / | 20 |
Đọc ở bước sòng 340 nm trong 3 phút
3.4.5 Phân tích protein
Nguyên tắc: lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry et al., (1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Trong môi trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi folin được đưa vào, folin sẽ kết dính với protein. Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ vàng sang xanh.
Chuẩn bị hóa chất:
Thuốc thử:
o Mẫu chuẩn: BSA 10mg/ml H2O
o 1N NaOH
o Hỗn hợp A: pha trộn trước khi sử dụng: 150 ml Na2CO3 2%
1,5ml Cu2SO4.5H2O 1%
1,5 ml NaK tartrate (C4H4KNaO6)
o Thuốc thử Folin (màu vàng): hòa trộn trước khi sử dụng: 10ml Folin
+ 10ml nước cất.
Quá trình phân tích protein:
Bảng 3.3: Quá trình thiết lập đường chuẩn và phân tích protein
Đường chuẩn | Mẫu | |||||||
0 mg | 0,01 mg | 0,03 mg | 0,06 mg | 0,09 mg | 0,15 mg | 0,2 mg | ||
Protein | Protein | Protein | Protein | Protein | Protein | Protein | ||
BSA | 0µL | 1 µL | 3 µL | 6 µL | 9 µL | 15 µL | 20 µL | / |
Mẫu | / | / | / | / | / | / | / | 10 |
H2O | 500 µL | 499 µL | 497 µL | 494 µL | 491 µL | 485 µL | 480 µL | 490 µL |
NaOH | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL |
Ủ trong 30–120 phút | ||||||||
Hỗn hợp A | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml |
Ủ trong 15 phút | ||||||||
Folin | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500 µL | 500µL | 500 µL |
Ủ trong 30 phút | ||||||||
Đọc ở bước sóng 660 nm | ||||||||
3.5 Tốc độ tăng trưởng
- Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối (g/ngày) (DWG) DWG = (Wc – Wđ)/t.
Trong đó:
Wc: khối lượng cuối (g) Wđ: khối lượng đầu (g)
t: thời gian thí nghiệm (ngày)
- Tỷ lệ sống (survival rate - %) =100x(số lượng thu được/số lượng thả)
- Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR – feed conversion ratio) FCR = Lượng thức ăn cá sử dụng/khối lượng gia tăng
3.6 Các chỉ tiêu khác
- NO2- phân tích theo phương pháp Griess llosvay, Diazonium
- NO3- phân tích theo phương pháp Salycilate
- Oxy đo bằng máy YSI (Mỹ)
- NH3 đo bằng máy YSI (Mỹ)
3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu phân tích giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (std), sai số chuẩn (SE) và phân tích phương sai tìm sự khác biệt giữa các nghiệm thức (phân tích one-way ANOVA và phép thử Duncan), sử dụng mềm Microsoft Office Excel 2003 và SPSS 16.0.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Giá trị LC50 –96 giờ của hoạt chất quinalphos đối với cá rô phi
4.1.1 Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy nhiệt độ trung bình buổi chiều cao hơn buổi sáng 0,20C nhưng nhiệt độ trung bình không khác biệt lớn ở các bể thí nghiệm. pH trong quá trình thí nghiệm tương đối ổn định và nằm trong giới hạn cho phép và dao động từ 7,13 đến 7,14 giữa sáng và chiều.
Ở các bể thí nghiệm hàm lượng oxy trung bình 3,3 mg/L vào buổi sáng và 3,1 mg/L vào buổi chiều. Hàm lượng oxy hoà tan từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến thời điểm cuối thí nghiệm có sự chênh lệch lớn là do suốt quá trình thí nghiệm các bể tiến hành trong điều kiện hoàn toàn không sục khí, cá sử dụng oxy trong quá trình hô hấp làm giảm dần lượng oxy hòa tan trong nước, tuy nhiên lượng oxy gần như đồng nhất giữa các nghiệm thức ở từng thời điểm.
Bảng 4.1: Các yếu tố môi trường trong thí nghiệm LC50–96 giờ
Sáng | Chiều | |
pH | 7,13±0,10 | 7,14±0,10 |
Oxy | 3,30±1,89 | 3,30±1,89 |
Nhiệt độ | 27,2±0,20 | 27,4±0,20 |
Giá trị trình bày trung bình±độ lệch chuẩn
Nhìn chung các điều kiện môi trường trong quá trình thí nghiệm là ổn định và gần như đồng nhất giữa các bể, không gây ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý và thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá thí nghiệm.
4.1.2 Kết quả thí nghiệm LC50–96 giờ
Giá trị LC50–96 giờ của cá rô phi tiếp xúc hoạt chất quinalphos được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971). Kết quả phân tích trên phần mềm SPSS 16.0 cho giá trị LC50–96h là 0,84 mg/L.
Ở cá rô phi giá trị LC50–96 giờ cũng đã được nghiên cứu xác định khi cho cá tiếp xúc nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau. Theo nghiên cứu của Pathiratne và George (1998) thì khi cho cá rô phi tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ có hoạt chất malathion giá trị LC50–96 giờ là 2 mg/L. Một nghiên cứu khác cũng trên cá rô phi khi cho tiếp xúc với hoạt chất diazinon giá trị LC50–96 giờ được xác định là 2,8 mg/L (El-Sherif et al., 2009). Như vậy
trong cùng nhóm lân hữu cơ hoạt chất quinalphos độc hơn rất nhiều so với malathin và diazinon. Một nghiên cứu khác khi cho cá rô phi tiếp xúc với hoạt chất deltamethrin thuộc nhóm pyrethroid giá trị LC50–96 giờ tương đối thấp 15,5 µg/L (Josephine et al., 2006). Tuy nhiên, giá trị LC50–96 giờ ở hoạt chất diamethoate tương đối khá cao là 20,7 mg/L (Auta et al., 2004). Có thể nói rằng giá trị LC50–96 giờ ở cá rô phi khác nhau ở từng loại thuốc BVTV và giá trị này tăng hay giảm tùy theo độ độc của thuốc và kích cỡ cá.
Tương tự như các loại thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ khác, hoạt chất quinalphos cũng được nghiên cứu xác định ngưỡng gây chết trên nhiều loài động vật thủy sản. Ở cá Channa punctatus thì nồng độ gây chết LC50–96 giờ có giá trị là 0,25 mg/L (Sastry và Siddiqui, 1982), trong khi đó ở cá chép (cyprinus carpio) cỡ 2 ± 0,2 g là 7,5 µg/L (Chebbi et al., 2009). Giá trị LC50- 96 giờ này tương đối thấp điều đó cho thấy rằng hoạt chất quinalphos không chỉ độc với cá rô phi mà còn trên cá khác.
Ngoài ra, giá trị LC50 của các loại hóa chất khác nhau đối với các loài cá cũng khác nhau. Nghiên cứu cho thấy giá trị LC50–96 giờ của carbaryl đối với cá chép (Cyprinus carpio) cỡ 0,6 g là 0,72 mg/L, malathion là 0,82 mg/L, parathion methyl là 0,85mg/L (Luciano và Giovanna, 1990, trích dẫn bởi Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2009). Mức độ độc của Basudin 40EC đối với cá chép, cá mè vinh và cá rô phi gần như tương đương nhau, giá trị LC50–96 giờ lần lượt là 3,66 mg/L, 3,69 mg/L và 3,50 mg/L (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999). Giá trị LC50–96 giờ của hoạt chất fenobucarb với cá lóc (Channa striata) là 11,4 mg/L (Nguyễn Văn Công và ctv, 2006).
4.2 Ngưỡng ức chế men ChE trong não và cơ gây chết cá
4.2.1 Hoạt động của cá trong thời gian thí nghiệm
Ở nghiệm thức đối chứng cá có màu sáng, các sọc trên thân hơi mờ, cá hoạt động bình thường, phản ứng nhanh với tiếng động và cá thường tập trung theo đàn và di chuyển nhanh. Tuy nhiên, cá ở nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) sau 1 giờ tiếp xúc với thuốc thì các sọc trên thân cá bắt đầu chuyển sang màu đậm hơn so với đối chứng, cá phần lớn tập trung dưới đáy bể. Ở thời điểm 6 giờ của nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,84 mg/L thì đa số cá toàn thân chuyển sang màu đen, lúc này cá phân tán đều trong bể, một số con bơi trên mặt nước và hoạt động mạnh. Ở nghiệm thức có nồng độ 0,63 mg/L thì một số cá có sọc đậm; nghiệm thức nồng độ 0,42 mg/L và 0,08 mg/L cá vẫn hoạt động bình thường.
Ở thời điểm 24 giờ các bể ở nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) có biểu hiện ngấm thuốc và một số con hoạt động bất thường. Sau 30 giờ khi tiếp xúc với thuốc ở nồng độ cao nhất (0,84 mg/L) cá bắt đầu chết, trong khi đó cá ở bể đối chứng hoạt động bình thường. Những cá sắp chết có biểu hiện bơi lội mất thăng bằng, có lúc vây đuôi vẫy mạnh vọt thẳng lên phía trước, đôi lúc bơi lội mất định hướng, thân cá có lúc bị cong lại. Hai vây bơi hoạt động liên tục đẩy cá về phía trước và có lúc cá bơi giật lùi trở lại. Có trường hợp chỉ còn một bên vây hoạt động (vây ngực phải hoặc trái) làm cá bơi nghiêng, cá bơi chậm dần, lờ đờ, không giữ được thăng bằng dần dần chìm xuống đáy bể, không còn khả năng bơi lội, chỉ còn nắp mang và miệng cử động, vây bơi đôi lúc hoạt động do cơ bị tê giật và sau một lúc cá dừng hẳn. Thời gian từ lúc cá có các biểu hiện bơi lội khác thường đến lúc cá chết thường kéo dài từ 30–60 phút.
A
B
Hình 4.1: Cá bị sẫm màu (A) và cá bình thường không bị sẫm màu (B)
4.2.2 Hoạt tính ChE ở não và cơ của cá bắt đầu chết
Cá chết tập trung chủ yếu ở hai nồng độ cao nhất là 0,84 mg/L và 0,63 mg/L. Hai nghiệm thức có nồng độ 0,42 mg/L và 0,08 mg/L cá vẫn hoạt động đến thời điểm kết thúc thí nghiệm (sau 96 giờ). Hoạt tính men ChE ở cơ và não của cá sắp chết và số cá còn sống được thu ở 96 giờ (thời điểm kết thúc thí nghiệm) được trình bày ở Hình 4.2 và Hình 4.3. Kết quả cho thấy khoảng thời gian cá chết tập trung nhiều ở hai nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất trong khoảng thời gian từ 30–65 giờ khi tiếp súc với thuốc. Ở nghiệm thức 0,84 mg/L cá chết hoàn toàn ở thời điểm 91 giờ sau khi tiếp xúc với thuốc; ở nghiệm thức có nồng độ thuốc thấp hơn (0,63 mg/L) thì đa số cá chết trước 96 giờ tuy nhiên đến thời điểm kết thúc thí nghiệm số cá chưa chết là 3 con.