Caáu Truùc Baäc 3 Cuûa Α

Dextrin + oligosaccharide

1.2.2 Hoạ t độ ng cuûa amylase:[2]

amylase

Tinh bộ t

Dextrin khoâng phaân nhaùnh

Amyloglucosidease

amylase

Dextrin

Maltose

Glucoza

Hình 1.16: Hoaït đoäng cuûa amylase

1.2.3 Enzyme amylase:

a.α –amylase:( EC 3.2.1.1)

Caáu taïo:

Enzyme α -amylase laø protein phaân töû löôïng thaáp, thöôøng naèm trong khoaûng

50.000 đeán 60.000. Ñeán nay ngöôøi ta đaõ bieát raát roõ caùc chuoãi maïch axit amin cuûa 18 α -amylase. Nhöng chæ coù hai loaïi α -amylase laø taka-amylase töø Aspergillus oryzae vaø α -amylase cuûa tuïy lôïn, đöôïc nghieân cöùu kyõ veà hình theå khoâng gian cuûa caáu truùc baäc ba. Môùi đaây, caùc nhaø nghieân cöùu cho thaáy caùc chuoãi maïch axit amin cuûa enzyme α -amylase đeàu coù caáu truùc baäc 3 töông töï nhau.

Hình 1.17: Caáu truùc baäc 3 cuûa α - amylase

Noùi chung, α -amylase đeàu coù caáu truùc töø 3 vuøng khaùc nhau:

- Vuøng trung taâm A: coù kích thöôùc lôùn ôû daïng thuøng (α − β )8.

- Vuøng B naèm giöõa tôø giaáy xeáp b thöù 3 vaø xoaén oác a tieáp sau caáu truùc (a-b)8. Vuøng naøy đöôïc taïo neân töø ba tôø giaáy xeáp b đoái song song vaø moät voøng daøi coù caáu truùc it traät töï. Vuøng B naøy đöôïc gaén chaët vôùi vuøng A bôûi moät caàu disunfua.

- Vuøng C coù caáu truùc tôø giaáy xeáp b, vaø đöôïc lieân keát vôùi vuøng A, bôûi moät chuoãi đôn polypeptit. Tuøy theo nguoàn goác enzym, vuøng naøy coù theå mang theâm moät maïch gluxit.

Moät soá α -amylase đaëc bieät laø α - amylase töø tuïy lôïn vaø töø thöïc vaät coù chöùa

ion Ca . Ion naøy naèm ôû giöõa vuøng A vaø vuøng B, moät maët coù taùc duïng laøm oån đònh

caáu truùc baäc 3 cuûa enzyme vaø maët khaùc coù vai troø nhö chaát hoaït hoùa dò khoâng gian.

Taâm hoaït đoäng cuûa α -amylase naèm trong moät raõnh coù chieàu daøi khoaûng 3nm. Raõnh naøy naèm giöõa vuøng A ôû đaàu C cuûa noù vaø vuøng B. Caùc taâm hoaït đoäng cuûa caùc α -amylase khaùc nhau thöôøng đöôïc taïo neân bôûi 5 đeán 11 taâm phuï (A tôùi K) tuøy theo nguoàn goác cuûa enzyme.

ÔÛ taâm hoaït đoäng, cô chaát đöôïc giöõ trong tö theá moät hình theå bò uoán cong nhôø caùc lieân keát Van der Walls vôùi moät soá axitamin thôm cuõng nhö caùc lieân keát hydro giöõa caùc maïch beân cuûa caùc axitamin coù cöïc vaø cô chaát. Matsura vaø coäng söï (1984) cho raèng sieâu caáu truùc (a-b)8 taïo ra moät tröôøng tónh đieän coù löïc huùt maïnh, coù theå coù aûnh höôûng tôùi toaøn boä quaù trình xuùc taùc, nghóa laø tôùi söï gaén cô chaát, traïng thaùi chuyeån cuõng nhö tôùi söï giaûi phoùng saûn phaåm thuûy phaân.

Nhieàu taùc giaû đaõ chöùng minh đöôïc söï toàn taïi cuûa moät taâm gaén phuï khoâng đaëc hieäu naèm treân beà maët enzyme. Taâm naøy coù vai troø nhö moät caùi đieàu hoøa cuûa enzyme đeå choáng laïi söï kìm haõm caïnh tranh bôûi saûn phaåm thuûy phaân. Nhieàu nghieân cöùu veà naêng löôïng töông taùc cuûa moät goác glucose ôû cô chaát vôùi caùc taâm phuï khaùc nhau cuûa enzyme, cho thaáy caùc α -amylase đeàu coù đaëc tính chung sau:

- Naêng löôïng töông taùc cuûa caùc taâm töø A-E vôùi goác glucose luoân luoân döông. Töông taùc naøy thuaän lôïi cho vieäc giöõ chuoãi maïch ôû taâm hoaït đoäng sau khi đöùt lieân keát.

- Naêng löôïng cuûa taâm F (gaàn vôùi taâm xuùc taùc) vôùi goác glucose thì hôi aâm cho tôùi döông maïnh. Ñieàu naøy tuøy thuoäc vaøo nguoàn enzyme.

- Naêng löôïng töông taùc cuûa taâm G laø döông. Chính vì vaäy noù taïo đieàu kieän hình thaønh cho phöùc enzyme - cô chaát. Phöùc naøy seõ khoâng đöôïc taïo ra vôùi caùc chuoãi maïch ngaén maltooligosaccharide., chính caùc chuoãi maïch ngaén naøy laïi laø chaát kìm haõm caïnh tranh khi ôû noàng đoä cao.

- Taâm xuùc taùc cuûa α -amylase coù leõ chæ đöôïc giôùi haïn ôû hai axitamin axit tính (aspartic hay glutamic) naèm trong vuøng gaén cô chaát. Cô cheá thuûy phaân baét đaàu baèng söï laøm yeáu lieân keát glucozit C1-C4 phaûi thuûy phaân, do keát quaû cuûa vieäc taïo neân phöùc enzyme-cô chaát. Lieân keát naøy laïi moät laàn nöõa bò yeáu đi döôùi taùc duïng cuûa moät trong hai axitamin axit tính đoùng vai troø laø chaát cho proton tôùi C4. Khi lieân keát glucoside bò đöùt seõ taïo neân moät ion oxicacbonium (traïng thaùi chuyeån). Ion naøy đöôïc oån đònh bôûi đieän tích aâm cuûa moät axit amin khaùc.

Cuoái cuøng, ion oxicacbonium taùc duïng vôùi moät phaân töû nöôùc vaø hai oligosaccharide đöôïc taïo thaønh lieàn rôøi boû taâm hoaït đoäng cuûa enzyme.

Tính chaát:

pH toái öu cuûa α -amylase phuï thuoäc vaøo nguoàn goác enzyme. Noùi chung, pH toái öu naèm trong khoaûng axit yeáu 4,8 - 6,9. Tuy nhieân coù moät soá α -amylase chòu axit cao nhö α -amylase töø Bacillus acidocaldarious (pH toái öu 3,5) vaø chòu kieàm maïnh nhö α -amylase töø Bacillus licheniformis ( pH toái öu 9,0). Söï coù maët cuûa ion Canxi cho pheùp caûi thieän đoä oån đònh cuûa enzyme đoái vôùi söï thay đoåi cuûa pH.

- Nhieät đoä hoaït đoäng toái öu cuûa α -amylase cuõng phuï thuoäc vaøo nguoàn goác

enzyme. Noùi chung nhieät đoä toái öu naèm trong khoaûng 40-50 C, nhöng coù theå đaït tôùi

giaù trò gaàn 70-80 C đoái vôùi α -amylase töø vi khuaån nhö B.sterothermophilus,

B.subtilis, B.licheniformis.

Cô cheá taùc duïng cuûa α -amylase:

Enzyme α -amylase thuûy phaân lieân keát α -1,4 treân nhieàu maïch vaø toàn taïi nhieàu vò trí cuûa cuøng moät maïch, giaûi phoùng ra glucose vaø caùc oligosaccharide coù töø 2-7 đôn vò glucose, trong đoù 1 glucose khöû taän cuøng ôû daïng α . Keát quaû taùc đoäng cuûa α - amylase thöôøng laøm giaûm nhanh đoä nhôùt cuûa dung dòch tinh boät, do đoù coøn goïi laø α - amylase dòch hoùa. Caùch thöùc taùc duïng cuûa α -amylase phuï thuoäc nguoàn goác enzyme vaø baûn chaát cuûa cô chaát.

Khi thuûy phaân amylose saûn phaåm cuoái cuøng chuû yeáu laø maltose vaø maltotriose. Do maltotriose beàn hôn neân vieäc thuûy phaân noù thaønh maltose vaø glucose đöôïc thöïc hieän sau đoù.

Coù hai cô cheá taùc duïng leân amylose ôû trong dung dòch: cô cheá taán coâng nhieàu laàn vaø cô cheá taán coâng öu tieân.

Trong cô cheá taán coâng nhieàu laàn, söï tieáp xuùc giöõa caùc enzyme vaø cô chaát xaûy ra moät caùch ngaãu nhieân vaø taát caû caùc lieân keát đeàu coù theå bò thuûy phaân. Sau khi thuûy phaân, duy nhaát chæ coù moät phaân töû đöôïc giaûi phoùng khoûi enzyme, coøn phaân töû kia đöôïc giöõ laïi trong loøng cuûa enzyme thì tröôït doïc theo trung taâm hoaït đoäng đeå chòu söï thuûy phaân môùi. Sau nhieàu laàn laëp laïi quaù trình naøy, chuoãi maïch đöôïc giaûi phoùng noát.

Trong cô cheá taán coâng öu tieân, söï tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát chæ daãn tôùi moät laàn thuûy phaân duy nhaát, caû hai phaân töû đöôïc giaûi phoùng ra sau khi xuùc taùc. Vaø khoâng phaûi taát caû moïi lieân keát đeàu maãn caûm nhö nhau đoái vôùi enzyme, nhaát laø caùc lieân keát ôû đaàu chuoãi thöôøng beàn hôn.

Cô cheá taán coâng nhieàu laàn đaõ đöôïc xaùc nhaän baèng thöïc nghieäm, thöôøng thaáy đoái vôùi enzyme α -amylase cuûa dòch tuïy lôïn. Coøn cô cheá taán coâng öu tieân đaõ đöôïc nghieân cöùu đoái vôùi caùc enzyme α -amylase cuûa nöôùc boït, cuûa naám moác vaø vi khuaån khi phaûn öùng vôùi dung dòch amylose.

Trong tröôøng hôïp chuoãi maïch thaúng coù möùc đoä truøng hôïp thaáp thì cô cheá taán coâng nhieàu laàn coù xaùc xuaát raát thaáp töø 0,1 - 0,27 đoái vôùi nhieàu α -amylase. Trong tröôøng hôïp naøy hai chuoãi maïch rôøi khoûi trung taâm hoaït đoäng ngay sau khi thuûy phaân, nhöng do bò vaây bôûi caùc phaân töû dung moâi neân xaùc xuaát đeå cho phaàn đöôïc thuûy phaân trôû laïi laø lôùn.

Khi thuûy phaân amylopectin trong dung dòch ngoaøi glucose, maltose vaø maltotriose coøn coù theâm caùc dextrin giôùi haïn coù nhaùnh. Caùc α -dextrin giôùi haïn naøy coù chöùa caùc lieân keát α -1,6 cuûa polymer ban đaàu coäng vôùi caùc lieân keát α -1,4 keà beân thöôøng beàn vôùi thuûy phaân.

Caùc giai đoaïn thuûy phaân tinh boät cuûa α -amylase:

Giai đoaïn dextrin hoùa:

Khaû naêng dextrin hoùa cuûa α -amylase raát cao do đoù ngöôøi ta coøn goïi laø α - amylase laø amylase dextrin hoùa hay amylase dòch hoùa .

Ñaëc tính: α -amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau coù thaønh phaàn amino acid khaùc nhau, moãi loaïi α -amylase coù moät toå hôïp amino acid đaëc hieäu rieâng. α -amylase laø moät protein giaøu tyrosine, tryptophan, acid glutamic vaø aspartic. Caùc glutamic acid vaø aspartic acid chieám khoaûng ¼ toång löïông amino acid caáu thaønh neân phaân töû enzym. α -amylase coù ít methionine vaø coù khoaûng 7-10 goác cysteine.

Troïng löôïng phaân töû cuûa α -amylase malt laø 59.000kDa.

Amylase deã tan trong nöôùc, trong caùc dung dòch muoái vaø röôïu loaõng. Protein cuûa caùc amylase coù tính acid yeáu vaø coù tính chaát cuûa globuline. Ñieåm đaúng đieän naèm trong vuøng pH = 4,2 – 5,7.

α - amylase laø moät metaloenzym. Moãi phaân töû α -amylase đeàu coù chöùa 130 nguyeân töû gam Ca/mol, nhöng khoâng ít hôn 1 6 nguyeân töû gam/mol. Ca tham gia vaøo söï hình thaønh vaø oån đònh caáu truùc baäc 3 cuûa enzym, duy trì söï toàn taïi cuûa enzyme bò taùc đoäng bôûi caùc taùc nhaân gaây bieán tính vaø taùc đoäng cuûa caùc enzyme phaân giaûi

protein. Neáu phaân töû α -amylase bò loaïi boû heát Ca thì noù seõ hoaøn toaøn bò maát heát khaû naêng thuyû phaân cô chaát. α -amylase beàn vôùi nhieät đoä hôn caùc amylase khaùc. Ñaëc tính naøy coù leõ lieân quan đeán haøm löôïng Ca trong β phaân töû. Taát caû caùc amylase đeàu bò kìm haõm bôûi caùc kim loaïi naëng nhö: Cu2+, Ag+, Hg+

Ñieàu kieän hoaït đoäng cuûa α -amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau thöôøng khoâng gioáng nhau. Bieân đoä pH toái thích cho hoaït đoäng cuûa α -amylase töø malt khaùc vôùi α - amylase töø vi sinh vaät. pH toái thích cho hoaït đoäng cuûa α -amylase töø đaïi maïch naûy maàm vaø thoùc naûy maàm laø 5,3 (coù theå hoaït đoäng toát trong khoaûng pH = 4,7 - 5,4).

Ñoä beàn vôùi acid cuûa α -amylase malt keùm hôn so vôùi đoä beàn cuûa α -amylase naám moác.

Ñoä beàn cuûa α -amylase bò aûnh höôûng bôûi nhieät đoä vaø pH. Tuy nhieân so vôùi caùc loaïi amylase khaùc thì đoä beàn vôùi nhieät cuûa α -amylase cao hôn. ÔÛ 0oC vaø pH=3,6 α - amylase cuûa malt hoaøn toaøn maát hoaït tính. α -amylase cuûa maàm thoùc vaø malt hoaït đoäng toát nhaát ôû nhieät đoä 58 - 60oC. Do đoù trong saûn xuaát röôïu ngöôøi ta thöôøng duøng malt đeå đöôøng hoùa cô chaát ôû nhieät đoä 60 - 65oC.

Baûng 1.4: Ñoä beàn cuûa α - amyalase töø malt

Nhieät đoä (oC)

Nhieät đoä cuûa α -amylase(%) so vôùi ban đaàu	Nhieät đoä (oC)	Hoaït đoä cuûa α -amylase (%) so vôùi ban đaàu
65	100	80	25
70	100	85	1
75	58	90	0

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 96 trang tài liệu này.

d.β –amylase: ( EC 3.2.1.2) Caáu truùc vaø tính chaát cuûa β - amylase:

Hình 1.18: Cấ u trúc không gian β -amylase

Nhöõng hieåu bieát veà β -amylase coøn raát haïn cheá. Chæ coù caùc enzyme coù nguoàn goác thöïc vaät đöôïc bieát đeán nhieàu nhaát. Caùc enzym naøy đöôïc toång hôïp neân ôû trong caùc haït döôùi daïng tìm aån, sau đoù đöôïc hoaït hoùa trong quaù trình naûy maàm nhôø enzym proteaza. Gaàn đaây ngöôøi ta taùch chieát đöôïc β -amylase töø vi khuaån nhö Bacillus pseudomonas, B. streptomices.

Enzyme β -amylase đöôïc taïo ra töø moät chuoåi maïch polypeptide duy nhaát, coù khoái löôïng phaân töû 60.000, nhöng ngöôøi ta môùi chæ bieát đeán trình töï axitamin cuûa hai trong soá caùc enzyme naøy. Nghieân cöùu caùc chuoãi axit amin naøy đaõ phaùt hieän thaáy coù moät tæ leä gioáng nhau khoaûng 32%, đaëc bieät vôùi hai vuøng tham gia vaøo quaù trình thuûy phaân. Coù hai nhoùm tiol, trong đoù coù moät nhoùm hoaït đoäng hôn, tham gia tröïc tieáp hay giaùn tieáp vaøo quaù trình thuûy phaân, đaëc bieät chuùng coù khaû naêng gaén chaët caùc chaát kìm haõm hoaït đoäng cuûa enzyme nhö caùc daãn xuaát cuûa thuûy ngaân hay caùc peptit.

Tham gia vaøo cô cheá taùc duïng cuûa β -amylase thöôøng coù moät nhoùm cacboxyl theå hieän tính chaát aùi nhaân vaø moät nhoùm imidazol theå hieän tính chaát aùi electron. Söï nghòch đaûo hình theå cuûa cacbon anome (C1) đöôïc thöïc hieän nhôø vieäc taïo thaønh hôïp chaát đoàng hoùa trò trung gian kieåu este-axetal giöõa cacbon anome vaø nhoùm cacboxyl cuûa taâm hoaït đoäng. Sau đoù este naøy bò phaân huûy bôûi taùc đoäng cuûa moät phaân töû nöôùc leân nhoùm este đeå giaûi phoùng ra α -maltose vaø hoaøn nguyeân nhoùm cacboxyl cuûa enzyme.

Caùc enzyme β -amylase coù pH toái öu naèm trong khoaûng 5-6 vaø nhieät đoä toái

öu khoaûng 50 C. Tuy nhieân, caùc β -amylase vi khuaån thöôøng coù tính beàn nhieät hôn

so vôùi β -amylase coù nguoàn goác thöïc vaät.

Baûng 1.5: Caùc tính chaát cuûa β -amylase

Nguồ n gố c enzym

Khố i lượng phân tử	pH tố i ưu	Nhiệ t độ tố i ưu, oC
- Thực vậ t:
Malt đđạ i mạ ch	56000	5.2
Luùa mì	64200	5.2 – 6.2	55
Ñoã töông	57000	5.4	55
Khoai lang	50000	5 - 6	50 – 55
- Vi sinh vaät:
B. cerus	58000	7	40
B. polymyxa	42000	7.5	40
B .megaterium	58000	6.5	40 - 65

Cô cheá taùc duïng cuûa β - amylase:

Enzyme naøy xuùc taùc thuûy phaân caùc lieân keát α -1,4 cuûa amylose vaø amylopectin ôû đaàu khoâng khöû cuûa maïch vaø giaûi phoùng ra maltose coù daïng β . Taùc đoäng cuûa enzyme seõ ngöøng laïi ôû choå saùt vôùi lieân keát α -1,6. Amylose thöôøng bò thuûy phaân hoaøn toaøn trong khi đoù, trong cuøng đieàu kieän thì chæ coù 55% amylopectin đöôïc chuyeån thaønh β -maltose. Phaàn coøn laïi cuûa söï thuûy phaân amylopectin laø moät β - dextrin giôùi haïn coù phaân töû löôïng cao vaø coù chöùa taát caû caùc lieân keát α -1,6 cuûa phaân töû ban đaàu.

Caùc enzyme β -amylase taùc duïng theo cô cheá taán coâng boäi, coù nghóa laø enzyme seõ thuûy phaân laàn löôït nhieàu lieân keát glucoside cuûa cuøng moät chuoãi tröôùc khi đöôïc rôøi ra khoûi moâi tröôøng. Soá laàn taùc đoäng laëp laïi cuûa enzyme leân cuøng moät chuoãi maïch α -glucan phuï thuoäc vaøo kích thöôùc cuûa chuoãi maïch naøy, thöôøng khoaûng baèng 4 đoái vôùi chuoãi maïch ngaén vaø taêng leân đoái vôùi chuoãi maïch daøi hôn.

Caùc amylase taïo ra caùc oligosaccharide đaëc thuø:

Caùc amylase ngoaïi maïch naøy thöôøng taïo ra caùc oligosaccharide đaëc thuø, chöùa töø 3-6 đôn vò glucose tuøy thuoäc nguoàn goác enzyme. Caùc enzyme naøy đaõ đöôïc phaùt hieän ra caùch đaây 20 naêm trong caùc canh tröôøng vi khuaån. Vieäc phaân laäp đöôïc caùc enzyme naøy đaõ taïo ra thuaän lôïi lôùn hôn cho saûn xuaát ôû qui moâ coâng nghieäp caùc oligosaccharide đaëc thuø vôùi möùc đoä tinh khieát cao. Ñoù laø:

+ Amylase töø S. griseus giaûi phoùng ra maltotriose.

+ Amylase töø P.stutzeri giaûi phoùng ra maltotetraose.

+ Amylase töø B. licheniformis giaûi phoùng ra maltopentaose .

+ Amylase töø A. aerogenes giaûi phoùng ra maltohexaose.

Cô cheá taùc duïng cuûa chuùng töông đoái gaàn vôùi cô cheá taùc đoäng cuûa β - amylase. Chuùng thöôøng thuûy phaân caùc lieân keát α -1,4 glucoside ôû đaàu khoâng khöû cuûa maïch α -glucan vaø giaûi phoùng ra caùc saûn phaåm daïng α . Caùc maïch thaúng nhö laø amilose seõ bò thuûy phaân hoaøn toaøn thaønh nhöõng oligosaccharide đaëc hieäu cuûa enzyme.

Vôùi amylopectin thì caùc enzyme naøy seõ döøng laïi ôû đieåm phaân nhaùnh coù lieân keát α -1,6 đeå taïo ra caùc dextrin giôùi haïn coù phaân töû löôïng cao.

Baûng 1.6 : Ñaëc tính cuûa caùc amylase taïo ra caùc oligosaccharide đaëc thuø

Oligosaccharide taïo ra

Maltotriose	Maltotetraose	Maltopentaose	Maltohexanose
Khoái löôïng phaân töû	55000	56000	22500	65000
pH toái öu	5,6 - 6,0	8,0	5,0 - 8,0	7,0
Nhieät đoä toái öu	45	45	76	52

Taùc duïng cuûa β -amylase leân tinh boät nhö sau:

Tinh boät (glucogen)

β -amylase

Maltose (54-58%) + β deztrin (42-46%)

Neáu tinh boät bò thuûy phaân đoàng thôøi bôûi caû α -amylase vaø β -amylase thì löôïng tinh boät seõ bò thuûy phaân đeán 95%.

boät:

Söï khaùc nhau giöõa α -amylase vaø β -amylase khi xuùa taùc söï thuûy phaân tinh

β -amylase haàu nhö khoâng thuûy phaân caùc haït tinh boät nguyeân veïn nhöng noù

phaân huûy hoà tinh boät raát maïnh.

β -amylase phaân giaûi 100% amylose thaønh maltose.

β -amylase phaân giaûi 54 58% amylopectin thaønh maltose.

β -amylase laø moät albumin, taâm xuùc taùc coù chöùa nhoùm –SH, nhoùm –COOH vaø voøng imidazol cuaû caùc goác histidine vaø laø enzyme ngoaïi baøo.

β -amylase khoâng beàn khi coù Ca2+, β -amylase bò kìm haõm bôûi Cu2+, Hg2+, urea, indoacetamide, iodin, ozone…

β -amylase chòu nhieät keùm hôn α -amylase nhöng beàn vôùi acid hôn. β - amylase bò baát hoïat ôû nhieät đoä 70oC. Nhieät đoä hoaït đoäng toái thích cuûa β -amylase laø 55oC, pH = 5,1 - 5,5.

α -amylase cuøng vôùi β -amylase coù trong maàm cuûa luùa maïch. Tuy nhieân, trong coâng nghieäp ngöôøi ta saûn xuaát amylase töø tuïy taïng đoäng vaät hoaëc nuoâi caáy vi sinh vaät.