(TCVN 6427-2:1998) [18]; Trộn mẫu thử với dung dịch chiết axit oxalic 2% (m/m), sao cho thể tích dịch chiết, tính bằng mililit gấp từ 1 đến 5 lần khối lượng phần mẫu thử tính bằng gam. Lọc dung dịch, loại bỏ vài miliit dịch lọc ban đầu. Dung dịch thuốc nhuộm mầu Hòa tan 50mg muối natri của 2,6 diclorophenolindophenol trong 150ml nước nóng (50-600C) chứa 42mg natri hydro cacbonat trong bình định mức dung tích 200ml thêm nước đến vạch và lọc, cho đến khi có màu hồng bền ít nhất trong 5 giây. Lặp lại quá trình này thêm hai lần, và ghi lại thể tích dung dịch thuốc nhuộm mầu đã sử dụng cho mỗi lần, chính xác đến 0,1ml. Thực hiện ba lần của cùng một mẫu. Lấy kết quả trung bình cộng các giá trị thu được của ba lần xác định. Hàm lượng axit ascorbic, biểu thị bằng miligam trên 100g sản phẩm theo công thức sau:
Trong đó: m0 là khối lượng của phần mẫu thử trong phần dịch lấy để chuẩn độ, tính bằng gam; m1 là khối lượng của axit ascorbic tương đương với 1,0 ml dung dịch thuốc nhuộm, tính bằng miligam; V0 là thể tích của dung dịch thuốc nhuộm dùng chuẩn độ, tính bằng mililit; V1 là thể tích của dung dịch thuốc nhuộm dùng trong mẫu trắng tính bằng mililit. Lấy kết quả trung bình cộng các giá trị thu được của ba lần xác định.
Hàm lượng β-carotene (µg/g): xác định theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 8972-2:2011) [19]; Chiết β-caroten ra khỏi dung dịch mẫu đã xà phòng hóa bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp. Lặp lại quy trình chiết từ 3 đến 4 lần dùng các lượng từ 50 ml đến 150 ml. Rửa hỗn hợp các dịch chiết bằng nước (thường từ 2 đến 4 lần, mỗi lần dùng từ 50 ml đến 150 ml) đến trung tính. Kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn, dùng tối thiểu ba mức pha loãng của dung dịch gốc β-caroten. Tiến hành ít nhất hai lần xác định độc lập. Tính nồng độ khối lượng của β-caroten tổng số, r, bằng mililit trên 100g mẫu (mg/100g), theo Công thức (2):
(2)
Trong đó:
là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với các đồng phân β-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử, tính bằng các đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao; | |
c | là độ tinh khiết đã được hiệu chỉnh của nồng độ β-caroten trong dung dịch chuẩn tính bằng microgam trên mililit (µg/ml); |
Vs | là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử tính bằng mililit (ml); |
Vst | thể tích bơm của dung dịch chuẩn, tính bằng microlit (µl); |
Ast | là diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với β-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử, tính bằng các đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao; |
M | là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g); |
ViS | là thể tích bơm của dung dịch mẫu thử, tính bằng microlit (µl); |
1000 | là hệ số chuyển đổi (microgam sang miligam); |
100 | là hệ số chuyển đổi về hàm lượng trên 100g. |
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Cây Bí Đỏ Bằng Chỉ Thị Hình Thái -
Nghiên Cứu Bản Đồ Di Truyền Phân Tử Nguồn Gen Bí Đỏ -
Các Mẫu Giống Bí Đỏ Sử Dụng Làm Vật Liệu -
Phân Nhóm Các Mẫu Giống Bí Đỏ Nghiên Cứu Theo Đặc Điểm Hình Thái Thân, Lá -
Phân Nhóm Các Mẫu Giống Bí Đỏ Nghiên Cứu Theo Các Yếu Tố Cấu Thành Năng Suất -
Thông Tin Của 14 Mẫu Giống Bí Đỏ Địa Phương Được Tuyển Chọn
Xem toàn bộ 201 trang tài liệu này.
2.4.3. Phương pháp xác định mẫu giống bí đỏ triển vọng
- Sử dụng chỉ số chọn lọc để chọn dòng:
i
k
A (x M )
2
i
i
i 1
Chỉ số chọn lọc giúp cho nhà chọn giống chọn được một hoặc nhiều giống (dòng) đồng thời trên một số tính trạng mong muốn theo mục tiêu đặt ra. Chỉ số chọn lọc được tính theo công thức:
I =
Dựa vào công thức này cho thấy: I = 0, khi tính trạng chọn lọc xi = đúng mục tiêu chọn giống (Mi); tuy nhiên điều này khó xảy ra. Như vậy, chỉ số chọn lọc càng tiến gần đến 0 thì giống (dòng được chọn lọc càng gần mục tiêu của người chọn giống.
Tiến hành tuyển chọn các giống bí đỏ địa phương triển vọng bằng chương trình chọn dòng (Selection Index) của Nguyễn Đình Hiền (1995) dựa
trên một số chỉ tiêu: năng suất thực thu, hàm lượng chất khô, độ brix, β- caroten và vitamin C. Với mục tiêu chọn lọc là giá trị mong muốn của từng chỉ tiêu trên; số mẫu giống bí đỏ tham gia tuyển chọn gồm 132 mẫu. Căn cứ vào tiêu chí tổng hợp để chọn ra được 14 mẫu giống gần nhất so với mục tiêu đặt ra, dựa theo khoảng cách Euclide (khoảng cách này không tính đến mối quan hệ giữa các biến), sử dụng làm vật liệu chọn tạo giống bí đỏ mới và giới thiệu cho sản xuất.
2.4.4. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống bí đỏ sử dụng chỉ thị phân tử SSR
2.4.4.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN của các mẫu giống bí đỏ và quần thể F2, F3 dưa phương pháp CTAB của Doyle et al., (1987) [39].
* Các bước tiến hành:
theo
1. Cắt 70- 80mg lá tươi, non nghiền trong ni-tơ lỏng thành dạng bột mịn.
2. Chuyển bột nghiền vào ống eppendorf 2ml đã có sẵn
3. Thêm 1ml dung dịch đệm chiết ủ 65oC trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều 1 lần.
4. Cho thêm 500 µl Chloroform: Isoamyl alcohol 24:1 (v:v), lắc đều 5 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút
5. Chuyển dịch phía trên sang ống eppendorf 2ml mới, thêm 500 µl Isopropanol để tạo tủa ADN. Ly tâm 12000 vòng/phút để thu tủa.
6. Rửa kết tủa 500µl đệm rửa I. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút để kết tủa.
7. Tiếp tục rửa bằng 500µl đệm rửa II. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút để kết tủa.
8. Để khô ADN sau đó hòa tan trong 500µl TE.
9. Khử RNA bằng cách thêm 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 37oC trong 3 giờ.
Chất lượng ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%
trong môi trường đệm TBE 0,5X cùng với lamda chuẩn, và nồng độ ADN của mỗi mẫu được định bằng máy đo quang phổ ở mức OD 260nm và OD 280 nm. Tỷ lệ OD260/OD280 cho biết độ tinh sạch của mẫu ADN.
ADN (µg/µl) = (OD260 x 50µg/µl)/1000.
2.4.4.2. Phương pháp nhận dạng ADN bằng PCR ở tập đoàn mẫu giống
- Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 20 µl bao gồm: 2µl PCR buffer 10x; 1,6µl dNTP 2,5mM; 1,4µl primer 25ng/ µl; 0,1µl green Taq (5U/µl); 5µl ADN (5ng/µl); 9,9 µl H20.
Điều kiện phản ứng:
- 95oC trong 5 phút;
- Lăp
lai
35 chu kỳ các bướ c dướ i đây:
+ 94 oC trong 1 phút;
+ Ta trong 1 phút (Ta là nhiệt độ gắn mồi SSR, nhiêt
đô ̣ cu ̣ thể tùy thuôc
vào mồi SSR đươc
sử dụng);
+ 72 oC trong 1 phút.
- 72 oC trong 10 phút
- Bảo quản sản phẩm PCR ở 4 oC.
Điện di và phát hiện sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 8% và máy soi UV Transilluminator.
2.4.4.3. Phương pháp phân tích số liệu kiểu gen
Các băng ADN (alen) được phát hiện sau điện di sẽ được sử dụng để phân tích, xác định đa dạng di truyền của các mẫu giống nghiên cứu. Trên gel/ảnh điện di; ở vị trí có băng ADN được mã bằng số 1, không có băng được mã là 0, băng không rõ ràng được mã là - (dấu gạch); kết quả sẽ nhận được bảng dữ liệu số hóa chứa các số 0 &1 của các mẫu giống. Bảng dữ liệu này sẽ được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các mẫu giống thông qua các chỉ tiêu như: hệ số đa dạng di truyền.
Số liệu phân tích SSR được nhập vào Excel và xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 để xây dựng ma trận tương đồng di truyền. Tiếp theo, vẽ sơ
48
đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các giống bí đỏ nghiên cứu được xây dựng bằng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair- Group Method with Arithmetical averages) [68].
Hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền tính theo công thức của Nei (1972) [82], Rohlf, F. J., 2000 [98]:
I = q12 Q1Q2
(Hệ số tương đồng di truyền)
D = - ln (I) (Khoảng cách di truyền)
*q 12: số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu
*Q1 và Q2: tổng số các alen của nguồn gen 1 và 2
k
Hệ số đa dạng di truyền hay hệ số thông tin đa hình (PIC) được tính theo công thức Mohammadi (2003) [74] như sau: PIC = 1 - ∑h 2 (hk: tần số xuất
hiện của alen thứ k).
Từ kết quả phân tích và tính toán được để đưa ra kết luận bổ sung cho những đánh giá về đa dạng di truyền trong bộ giống nghiên cứu.
2.4.5. Phương pháp xác định chỉ thị liên kết với tính trạng hàm lượng chất khô
Chỉ thi ̣phân tử ADN liên kết với tính trạng hàm lươn
g: chất khô, đươc
xác
điṇ h sử duṇ g phần mềm MAPMAKER/EXP3.0b và MAPMAKER/QTL 1.1. do
Lincoln et al., (1993) [68] xây dưn
g và thườ ng xuyên đươc
câp
nhâṭ, sử duṇ g đê
phân tích, xác điṇ h QTL và chỉ thi ̣liên kết trong lâp bản đồ phân tử .
Phần mềm MAPMAKER/EXP3.0b chuyên sử dung để xây dưng bản đồ
liên kết của các chỉ thi ̣phân tử ADN dưa của quần thể phân ly (F2, F3, Fn. v.v.).
trên phân tic
h/nhân
dang kiểu gen
Ghi nhận dữ liệu nhận dạng ADN ở các cây F2, ghi nhận kiểu gen là: nếu kiểu nhận dạng giống kiểu gen của giống bí đỏ SĐK3630 ghi nhận là A, giống kiểu gen của giống bí đỏ SĐK8571 ghi nhận là B, dị hợp tử (trung gian giữa SĐK8571 và SĐK3630 ghi nhận là H, không có dữ liệu ký hiệu là “-”.
Số liệu phân tích kiểu gen của quần thể con lai F2 và số liệu đánh giá các
tính trạng hàm lượng chất khô thông qua kiểu hình được nhập và xử lý bằng phần mềm Windows QTL Cartographer Version 2.5_011 (WinQTLCart
2.5_011). Viêc
xác điṇ h các QTL đươc
dưa
trên chỉ số LOD (Logarithm of
the odds ratio) là chỉ số cho biết khả năng QTL có mặt tại một vị trí trên bản đồ liên kết.
Giá trị LOD được tính theo công thức:
LOD= 2: khả năng có QTL gấp 100 lần so với không có QTL; LOD= 3: khả năng có QTL gấp 1000 lần so với không có QTL
Trong nghiên cứu này, mỗi vị trí được xác định có mặt QTL hàm lượng chất khô khi giá trị LOD ở vi ̣trí đó ≥ 2,0. Giá trị LOD càng lớn thì càng khẳng định chắc chắn sự có mặt của QTL tại vùng NST tương ứng.
Giá tri ̣R2 % cũng rất quan trong trong nghiên cứ u QTL. Giá trị này cho biết sự ảnh hưởng của QTL đến tính trạng tương ứng. R2 % chính là phần trăm tác động lên kiểu hình của mỗi tính trạng do QTL kiểm soát.
Giá trị “Hiệu ứng cộng thêm” (Additive effective) trong nghiên cứu QTL
được hiểu là hiệu quả cộng thêm vào biểu hiện tính trạng khi có mặt QTL tại vị trí nghiên cứu.
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu và phân tích kết quả
- Sử dụng các số liệu thống kê từ các nguồn tài liệu sẵn có; các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê dựa theo các phần mềm thích hợp Ms.Excel 2010 và IRRISTAT 5.0; sau đó tổng hợp số liệu sử dụng các tham số thống kê như: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến động,... để phân tích kết quả [9].
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu
3.1.1. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các mẫu giống bí đỏ
3.1.1.1. Thời gian sinh trưởng của các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu
Thời gian sinh trưởng (TGST) (ngày) là đặc điểm di truyền của giống, nhưng nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Đối với cây trồng nói chung, xác định được các giai đoạn sinh trưởng và có ý nghĩa quan trọng, với mỗi giai đoạn khác nhau cây trồng có các yếu tố về nước, dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm khác nhau,v.v.. Khi xác định được các giai đoạn sinh trưởng và phát triển ta có thể tác động bằng các biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao khả năng sinh trưởng, khả năng cho năng suất, chất lượng. Thời gian sinh trưởng của giống bí đỏ dài hay ngắn liên quan đến thời gian ra hoa cái, thời gian đậu quả, và thời gian thu hoạch quả. TGST được tính từ khi gieo đến khi thu hoạch lứa quả cuối cùng (cây tàn). Kết quả quan sát trong tập đoàn cho thấy thời gian sinh trưởng của 132 mẫu giống bí đỏ nghiên cứu sinh trưởng tốt trong điều kiện vụ Đông được chia thành các mức ở Hình 3.1 và Phụ lục 4.
Hình 3.1. Thời gian sinh trưởng của 132 mẫu giống bí đỏ địa phương trong nghiên cứu
Qua hình 3.1 cho thấy các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu có thời gian sinh trưởng từ 120 - 160 ngày, phổ biến là các nguồn gen có thời gian sinh trưởng (TGST) từ 141 - 150 ngày (64 nguồn gen, chiếm 48,48%); tiếp đến là các nguồn gen có TGST từ 151 - 160 ngày (37 nguồn gen, 28,03%), TGST 131 -
140 ngày có 16 nguồn gen (12,12 %), TGST <130 ngày có 9 nguồn gen (6,8%) và TGST rất dài (> 160 ngày) với 6 nguồn gen (4,5%). Kết quả nghiên cứu này tương tự với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Tâm Phúc và cs (2017)[16] đã chỉ ra rằng nên chọn lựa các giống bí đỏ có thời gian sinh trưởng từ 130 - 160 ngày để phù hợp hơn với sự thay đổi của cơ cấu mùa vụ và thời tiết. Do vậy, đa số các mẫu giống bí đỏ trong nghiên cứu có thể phù hợp trong tuyển chọn giống hoặc sử dụng làm bố hoặc mẹ trong lai tạo giống mới.
3.1.1.2. Đặc điểm hình thái thân, lá của các mẫu giống bí đỏ
Đặc điểm hình thái thân, lá ở giai đoạn trưởng thành mang tính đặc trưng quan trọng của nguồn gen, có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá về đặc điểm của giống, giúp phân biệt và nhận dạng các giống khác nhau. Kết quả đánh giá về đặc điểm hình thái thân, lá của 132 mẫu giống bí đỏ cho thấy các tính trạng màu xanh mặt trên của lá, độ phân cắt thùy lá, đặc điểm vết đốm bạc trên lá, tỷ lệ chiều rộng/chiều dài lá mầm, chiều dài lá, chiều rộng lá, chiều dài lóng thân đều được biểu hiện ở mức độ đa dạng khác nhau (Bảng 3.1).
Thân là bộ phận quan trọng nhất của cây bí, thân cây phát triển khỏe mạnh mới có đủ dinh dưỡng để nuôi cây và sinh nhiều nhánh mới. Chiều dài lóng thân ảnh hưởng tới độ che phủ của tán cây bí đỏ. Chiều dài lóng thân ngắn thì tán cây gọn gàng, đây là dạng hình phù hợp điều kiện thâm canh tăng mật độ nhằm tăng năng suất cây trồng. Các giống bí có chiều dài lóng thân lớn sẽ phù hợp cho việc trồng để lấy ngọn làm rau vì các giống này thường có khả năng phát triển thân lá nhanh và mạnh. Xác định được chiều dài lóng của lóng thân trong các giai đoạn khác nhau, ta cũng có thể xác định được nhu cầu dinh dưỡng của các giống trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây bí.