Các Mẫu Giống Bí Đỏ Sử Dụng Làm Vật Liệu

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU‌

2.1. Vật liệu nghiên cứu‌

2.1.1. Các mẫu giống bí đỏ sử dụng làm vật liệu‌

- Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học và đánh giá đa dạng di truyền gồm 132 mẫu giống bí đỏ địa phương được thu thập hiện đang lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia sử dụng để nghiên cứu một cách có hệ thống về đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng và đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR (Phụ lục 2).

- Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên quan đến hàm lượng chất khô gồm:

+ 12 mẫu giống bí đỏ đã được mô tả đánh giá và đang được lưu giữ trong ngân hàng gen cây trồng Quốc gia tại Trung tâm Tài nguyên thực vật

được sử dụng làm bố, mẹ để lai tao lượng chất khô cao.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 201 trang tài liệu này.

quần thể F2 và F3 theo hướ ng có hàm

+ Giống bí đỏ gáo - SĐK 3630 (làm mẹ) và Bí đỏ - SĐK 8571 (làm bố) được chọn lọc từ kết quả đánh giá 132 mẫu giống theo chỉ tiêu tuyển chọn của đề tài về hàm lượng chất khô được sử dụng làm vật liệu lai tạo quần thể F2, F3.

- 120 cá thể của quần thể F2 (SĐK3630x SĐK8571) được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá kiểu hình về hàm lượng chất khô của các dòng bí đỏ.

2.1.2. Chỉ thị phân tử SSR‌

- Sử dụng 48 chỉ thị SSR để nhận dạng cho cây bí đỏ đã được công bố phân tích đa dạng di truyền của tập đoàn 132 mẫu giống bí đỏ nghiên cứu.

- Sử dụng 300 chỉ thị phân tử SSR để nhận dạng ADN của các mẫu giống bí đỏ (bố và mẹ) trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử liên quan đến hàm lượng chất khô cao (Phụ lục 4).

- Sử dụng 69 chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống bố mẹ (SĐK3638 x SĐK8571) được sử dụng để nhận dạng ADN của quần thể F2 đối với tính

trạng hàm lượng chất khô (Phụ lục 5).

- Các thông tin tên, trình tự mồi của các chỉ thị SSR sử dụng được trình bày trong Phụ lục 3.

2.2. Nội dung nghiên cứu‌

Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của các mẫu giống bí đỏ

- Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các mẫu giống bí đỏ nghiên cứu.

- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống bí đỏ.

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của mẫu giống bí đỏ nghiên cứu.

- Xác định một số mẫu giống bí đỏ triển vọng sử dụng làm nguồn vật liệu cho chọn giống.

Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống bí đỏ sử dụng chỉ thị phân tử.

- Sự đa hình của các chỉ thị SSR với tập đoàn bí đỏ nghiên cứu.

- Quan hệ di truyền giữa các mẫu giống bí đỏ trong tập đoàn.

Nội dung 3: Xác định chỉ thị phân tử liên kết với hàm lượng chất khô cao, phục vụ chọn tạo giống bí đỏ chất lượng.

- Lựa chọn bố mẹ và lai tạo, đánh giá, chọn lọc tổ hợp lai F1 thích hợp cho nghiên cứu hàm lượng chất khô.

- Đánh giá hàm lượng chất khô của các cá thể con lai.

- Đánh giá kiểu gen của giống bố mẹ và quần thể con lai.

- Xác điṇ h chỉ thi ̣liên kết vớ i tính trang hàm lương chất khô.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu‌

Đề tài luận án được thực hiện từ tháng 10/2016 đến tháng 12/2019, cụ thể như sau:

* Nghiên cứu, đánh giá đặc điểm nông sinh của tập đoàn 132 mẫu giống bí đỏ từ tháng 12/2016 đến tháng 9/2017 tại An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội.

* Thí nghiệm đánh giá và xác định các mẫu giống bí đỏ triển vọng từ tháng 12/2016 đến tháng 9/2017 tại An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội.

* Các nội dung nghiên cứu thực hiện trong phòng thí nghiệm tại Trung tâm Tài nguyên thực vật (An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội), Viện nghiên cứu rau quả (Gia Lâm, Hà Nội) từ năm 2017-2018 gồm:

- Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống bí đỏ địa phương bằng chỉ thị phân tử SSR.

- Thí nghiệm đánh giá chất lượng các mẫu giống bí đỏ địa phương tiến hành từ tháng 9/2017 đến tháng 12/2017, tại Viện Nghiên cứu Rau quả, Trâu Quì, Gia Lâm, Hà Nội.

- Phân tích hóa sinh các mẫu giống bí đỏ tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Tài nguyên thực vật:

+ Tách chiết ADN tổng số đối với các mẫu giống nghiên cứu từ 10/2016 đến 6/2017.

+ Tiến hành PCR để nhận diện ADN của các mẫu giống từ 11/2016 đến 12/2018.

+ Phân tích đa dạng di truyền và xác định chỉ thị phân tử ADN đặc trưng cho các mẫu giống từ 12/2016 đến 12/2018 tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội.

+ Xác định chỉ thị liên kết từ 01/2018 đến 12/2019 tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội.

* Lai tạo quần thể F2 và F3 từ tháng 4 năm 2018 đến tháng 12/2019 tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội. Tháng 01/2020 thu quần thể.

2.4. Phương pháp nghiên cứu‌

Cách tiếp cận nghiên cứu của đề tài luận án được minh họa ở hình 2.1

Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận nghiên cứu của luận án‌

2.4.1. Phương pháp mô tả, đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của các mẫu giống bí đỏ‌

2.4.1.1. Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm đồng ruộng được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đủ - RCBD (Randomized Complete Block Design) với 3 lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 15m2 (6m x 2,5m). Luống trồng rộng 2,5 m, rãnh 0,3 m, cao luống 0,3 m.

- Kỹ thuật trồng và chăm sóc tuân theo quy trình canh tác cây bí đỏ do Trung tâm Tài nguyên Thực vật ban hành (2015) [22].

* Làm cỏ, bón phân và vun xới

- Bón lót: Trước khi trồng, bón toàn bộ lượng phân chuồng + toàn bộ lượng lân supe + ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali.

- Bón thúc lần 1: Sau khi trồng 20 - 25 ngày, bón ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali, bón thúc kết hợp làm cỏ, xới xáo nhẹ và vun nhẹ.

- Bón thúc lần 2: Sau khi trồng 40 - 50 ngày, bón ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali, kết hợp với làm cỏ, xới sâu, vun gốc chuẩn bị cho giai đoạn ra hoa.

- Bón thúc lần 3: Bón thúc nuôi quả, bón khi cây hình thành quả non, bón toàn bộ lượng phân còn lại kết hợp với làm cỏ.

* Tưới tiêu nước: Tưới đầy đủ cho thí nghiệm, đặc biệt trong giai đoạn gieo ươm cây con và giai đoạn sau trồng (giai đoạn đầu vụ: tháng 12, tháng 1), tưới nước theo rãnh khi cây đã lớn và nhu cầu nước cao, nhất là trong giai đoạn hình thành quả, giữ cho mặt luống ẩm nhưng tán cây phải khô thoáng. Tiêu nước kịp thời khi vào đầu mùa mưa cũng là giai đoạn quả lớn và chín.

* Thu hoạch: Tiến hành thu hoạch quả khi trên cây có khoảng 95% số quả ngả màu. Thu riêng từng ô, để quả trong phòng cho hạt chín đẫy, bổ quả, tách hạt, rửa sạch và phơi khô hạt trong điều kiện tránh ánh nắng trực tiếp.

+ Gieo ươm cây con trong khay, trồng cây con khi đạt 2 - 3 lá thật, trồng 2 hàng nanh sấu trên luống, cây cách cây 75 cm.

+ Lượng phân bón cho 1 ha là: 25 tấn phân chuồng, 250 kg urê, 450 kg supe lân và 300 kg kali.

2.4.1.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Phương pháp đánh giá các đặc điểm hình thái, nông sinh học: thực hiện theo biểu mô tả đánh giá nguồn gen cây bí đỏ do (Trung tâm Tài nguyên thực vật biên soạn và ban hành năm 2015) [22]. Các chỉ tiêu đánh giá được thực hiện trên 10 cây hoặc bộ phận của cây, riêng các chỉ tiêu về quả được quan sát trên 5 quả.

Thời gian sinh trưởng (ngày):

- Tính số ngày từ khi gieo đến thu quả chín cuối cùng.

+ Ngày gieo hạt (ngày)

+ Thời gian từ khi gieo hạt đến nảy mầm (ngày)

+ Tổng thời gian sinh trưởng (ngày)

- Giai đoạn quả, quả chín sinh lý

+ Hình dạng, chiều dài quả, đường kính quả.

+ Màu sắc của thịt quả.

+ Độ dày thịt quả.

- Các tính trạng đo đếm:

+ Kích cỡ phiến lá, đo chiều dài lá (cm) từ nút đầu lá đến hết thùy dưới của phiến lá; chiều rộng lá (cm) đo chiều rộng nhất của lá; chiều dài cuống lá (cm), đo từ cuống lá tới điểm cuống lá đính với phiến lá; chiều dài cuống lá (cm), đo từ gốc cuống lá tới điểm cuống lá đính với phiến lá; chiều dài quả (cm), đường kính quả (cm) đo phần rộng nhất của quả, sau đó lấy tỷ lệ chiều dài quả/đường kính quả; độ dày thịt quả (mm) đo phần dày nhất ở khoảng chứa hạt.

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng bí đỏ

Đánh giá chất lượng bí đỏ qua một số chỉ tiêu:

+ Màu sắc thịt quả: quan sát và khoanh mã điểm theo các trạng thái tính trạng phù hợp.

+ Cường độ màu sắc của thịt quả: quan sát và khoanh mã điểm theo các trạng thái tính trạng phù hợp.

- Yếu tố cấu thành năng suất và năng suất:

+ Số quả trung bình trên cây: đếm tổng số quả trên 3 cây và lấy giá trị trung bình

+ Khối lượng quả chín trung bình/quả (kg): cân khối lượng 5 quả, lấy giá trị trung bình.

+ Khối lượng quả/ô thí nghiệm (kg): cân toàn bộ số quả thu được trên ô

+ Năng suất lý thuyết (NSLT) (tấn/ha): (số cây trên m2 x số quả trên cây x khối lượng quả trung bình) x 10.000. Đơn vị tính: (Kg x 10-3)

+ Năng suất thực thu (tấn/ha) = năng suất của những cây cho thu hoạch thực tế trên mỗi ô thí nghiệm (cân tổng số các đợt thu/lô và quy ra năng suất 1 ha).

2.4.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa sinh liên quan đến chất lượng‌

Các chỉ tiêu chất lượng được phân tích trong phòng thí nghiệm và trên máy phân tích. Lựa chọn mẫu để phân tích được tiến hành ngẫu nhiên đối với quả chín sinh lý có hình dạng và khối lượng trung bình của các lần nhắc lại ở mỗi giống. Các mẫu được trộn đều để phân tích các chỉ tiêu bằng máy phân tích và phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Kiểm nghiệm chất lượng rau quả - Viện Nghiên cứu Rau Quả.

Phương pháp xác định các chỉ tiêu hàm lượng chất khô, độ brix của thịt quả, hàm lượng vitamin C, hàm lượng β-carotene được phân tích trong phòng thí nghiệm, cụ thể như sau:

Hàm lượng chất khô (%): xác định theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 10696:2015) [20]:

Về nguyên tắc: tiến hành xác định hao hụt khối lượng sau khi sấy bằng cách trộng kỹ mẫu với kieselguhr hoặc vật liệu tương tự, sấy sơ bộ hỗn hợp và cuối cùng sấy 2 giờ trong tủ sấy chân không nhiệt độ 70 oC ± 1oC và áp suất khoảng 6,6 kPa (66 mbar).

Thuốc thử: chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989. Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sấy như tủ sấy chân không, có bộ kiểm soát nhiệt độ tự động, nhiệt kế và áp kế chân không. Tủ sấy phải đảm bảo sao cho sự thay đổi nhiệt độ ở các vị trí khác nhau trong tủ không vượt quá 2 oC. Tủ sấy có bộ thông hơi, bộ kiểm soát nhiệt độ tự động và nhiệt kế. Tủ này cho phép lưu thông nhanh và đủ để trao đổi với không khí bên ngoài sao cho có thể bỏ nhanh độ ẩm ban đầu. Thiết bị làm khô không khí như một cột nhồi bằng hạt chống ẩm silicagel có thỉ thị mới được làm khô (hoặc vật liệu tương tự). Bơm chân không để tháo và duy trì áp suất không lớn hơn 6,6 kPa (66 mbar) trong tủ sấy. Đũa thủy tinh đủ dài để chạm đến mép trên của đĩa. Cân phân tích có độ chính xác ± 1mg. Khi chuẩn bị mẫu thử thông thường không

cần xử lý trước và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào khối lượng, các kết quả được biểu thị bằng phần trăm khối lượng. Trộn kỹ mẫu trước khi phân tích. Ở giai đoạn sấy sơ bộ cân khoảng 1,5g kieselguhr cho vào đĩa kim loại, tiếp đó đặt đĩa, mở nắp để bên cạnh, cho vào trong tủ sấy và sấy khô ở nhiệt độ 75oC sau tăng nhiệt độ lên tối đa 120oC trong ít nhất 4 giờ; sử dụng cân phân tích cân 3 lần lặp lại, thực hiện nhanh để tránh mọi thất thoát ẩm do bay hơi, sau đó tính giá trị trung bình [20].

Tính hàm lượng chất khô tổng số, bằng phần trăm, theo Công thức sau:

Tsm1

m2

100

Trong đó: Ts là hàm lượng chất khô tổng số, tính bằng phần trăm (%); m0 là khối lượng ban đầu của mẫu, tính bằng gam (g); m1 là khối lượng của đĩa chứa kieselguhr, nắp và tro, tính bằng gam (g); m2 là khối lượng của đĩa chứa kieselguhr và nắp, tính bằng gam (g); Cần tính đến mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu mẫu cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó. Hàm lượng chất khô tổng số bằng phần trăm (khối lượng) đến hai chữ số thập phân.

+ Tiêu chuẩn phân loại hàm lượng chất khô (%) theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 645:2005 [20] về tiêu chuẩn rau quả - Yêu cầu kỹ thuật.

Hàm lượng chất khô (%) < 6: thấp TCVN 10696:2015 [20] Hàm lượng chất khô (%) ≥ 6: cao TCVN 10696:2015 [20] Hàm lượng chất khô (%) > 10: rất cao [20]

- Độ brix của thịt quả (%): xác định bằng máy đo độ Brix Atago Model PAL-1: quả bí khô được gọt tách vỏ, lấy riêng phần thịt quả, ép lấy nước, sau đó nhỏ vào mắt máy đo Atago PAL-1; đo 3 lần lặp lại, sau đó tính giá trị trung bình [18].

- Đánh giá hàm lượng Vitamin C (mg/100g): xác định bằng phương pháp chuẩn độ bằng 2,6 Diclorophenolindophenol theo Tiêu chuẩn Việt Nam