Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Agnps Lên Khử Trùng Bề Mặt Và Cảm Ứng Mẫu Cấy

ẩm cao, mức độ carbohydrate và hormone cao, ánh sáng có cường độ thấp, áp lực nước và áp suất thẩm thấu thấp, sự trao đổi khí O2 và CO2 thấp, tích luỹ khí ethylene trong bình nuôi cấy. Những yếu tố này trong vi nhân giống giúp cây tăng sinh nhanh, nhưng thường phát sinh những trạng thái sinh lý, cấu trúc và hình thái không bình thường dẫn đến hiệu quả của quá trình nhân giống in vitrokhông cao, tỷ lệ sống sót trong giai đoạn thuần hoá thấp, tạo ra các sản phẩm không đạt chất lượng, giá thành sản xuất tăng [20]. Trong một vài hệ thống vi nhân giống cây hoa, cây ăn quả và cây dược liệu trên quy mô công nghiệp đang gặp phải những vấn đề khó khăn như hiệu quả của quá trình khử trùng bề mặt không cao, hiện tượng tái nhiễm trong quá trình nhân giống, hiệu quả của quá trình nhân giống thấp, lượng cây con bị chết khi chuyển ra ngoài điều kiện vườn ươm khoảng 10 – 40% hoặc cao hơn nữa [10]. Vì vậy, việc tạo được cây in vitro có chất lượng cao trong vi nhân giống sẽ quyết định được hiệu quả kinh tế trong quá trình sản xuất. Cho đến nay, các thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, hệ thống nuôi cấy, quang chu kỳ,... đã được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong vi nhân giống thực vật; nhưng trong một vài quy trình nhân giống vẫn chưa mang lại hiệu quả cao như mong đợi [20]. Do đó rất cần thiết phải tìm ra một nhân tố mới trong vi nhân giống thực vật sẽ mang lại những lợi ích đáng kể trong việc nâng cao chất lượng cây giống. Trong đó, vật liệu nano đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Đặc biệt, AgNPs và FeNPs được thu hút nhiều hơn so với các nano kim loại khác; do chúng có nhiều tính chất, đặc trưng được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực vi nhân giống thực vật [85]. Với những ưu điểm mà vật liệu nano mang lại thì AgNPs có thể thay thế các chất khử trùng thông dụng [Ca(ClO)2, HgCl2] trong khử trùng bề mặt mẫu cấy cũng như một chất điều hoà sinh trưởng điều tiết các quá trình phát sinh hình thái, sinh trưởng và phát triển thực vật; FeNPs có thể như một nguồn vật liệu mới thay thế Fe- EDTA trong môi trường vi lượng.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Lá non của cây salem (Limonium sinuatum) và dâu tây (Fragaria × ananassa) 3 tháng tuổi, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 3 năm tuổi sinh trưởng và phát triển tốt, không bị sâu bệnh thu nhận tại vườn ươm của Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) được sử dụng làm vật liệu cho nghiên cứu.

2.1.2. Dung dịch nano

Dung dịch AgNPs và FeNPs hóa trị 0 nồng độ 1000 ppm do Viện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) chế tạo và cung cấp [46].

AgNPs có kích thước 20 – 25 nm được chế tạo bằng phương pháp khử dung dịch nước sử dụng tiền chất là AgNO3, tác nhân khử là sodium borohydride (NaBH4) và chất ổn định được sử dụng là chitosan. AgNPs được sử dụng trong khử trùng bề mặt và bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro.

FeNPs có kích thước 20 – 60 nm được chế tạo bằng phương pháp khử dung dịch nước sử dụng tiền chất là FeSO4.7H2O. NaBH4 được sử dụng làm chất khử và carboxymethyl cellulose (CMC) làm chất ổn định. FeNPs được sử dụng thay thế Fe- EDTA trong môi trường nuôi cấy in vitro.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất

Thiết bị và dụng cụ: Cân điện tử, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy đo hàm lượng chlorophyll SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Nhật Bản), tủ sấy Sanyo MOV-112, tủ sấy Memmert, cân kỹ thuật Prescisa (Nhật Bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm, ẩm kế (JR-900A, Trung Quốc), máy lắc Hermle (Ðức), kính hiển vi soi nổi C-BD230 và CH30RF200, kính hiển vi điện tử huỳnh quang, kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800, máy quang phổ hấp phụ AAS-6650, máy sắc ký khí GC-CP 3380, đèn cồn, dao cấy, đĩa cấy, panh cấy, kéo, bình nuôi cấy, dây thun, nylon, găng tay,...

Hoá chất: Agar, gelrite (Việt Xô, Cty Phan Trần, Hồ Chí Minh); sucrose (Biên Hoà, Đồng Nai); các hoá chất được sử dụng trong môi trường MS (Murashige và Skoog) hoặc SH (Schenk và Hildebrandt), chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Merck, Sigma, Duchefa).

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh.

2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng phát sinh và tăng sinh phôi vô tính từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

2.2.4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.

Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy

Lá non của cây salem (3 tháng tuổi), dâu tây (3 tháng tuổi) và sâm Ngọc Linh (3 năm tuổi) được xử lý sơ bộ bằng cách rửa sạch dưới vòi nước máy. Sau đó các lá được đưa vào tủ cấy vô trùng và ngâm với cồn 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần. Các lá này tiếp tục được khử trùng bằng dung dịch AgNPs với các nồng độ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2; 0,5 g/L) trong các khoảng thời gian thay đổi (5; 10; 15; 20; 30 phút) và so sánh với nghiệm thức đối chứng là 1 g/L HgCl2 trong 5 phút trên đối tượng cây salem [83], dâu tây [122], sâm Ngọc Linh [53]. Những mẫu lá này sau khi khử trùng được rửa lại với nước cất khử trùng 3 lần và cắt thành hình tròn có đường kính 1 cm bằng dụng cụ cắt [11] dọc theo 2 bên gân chính của lá (không bao gồm gân chính). Các mẫu lá này được cấy trên các môi trường khác nhau với 30 bình thuỷ tinh (100 mL chứa 15 mL môi trường) trên 1 nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu.

Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem

Mẫu lá cây salem (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường

½MS có bổ sung 20 g/L sucrose; 1 mg/L picloram và 2,5 g/L gelrite [78]. Tỷ lệ nhiễm (%), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây

Mẫu lá dâu tây (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L TDZ, 0,1 mg/L IBA, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar [151]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu, chồi cao > 1,5 cm và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.

Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá sâm Ngọc Linh

Mẫu lá sâm Ngọc Linh (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,2 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar [15]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%), khối lượng tươi (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.

2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro

Mô sẹo xốp thu nhận từ thí nghiệm 1.1 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường lỏng ½MS có bổ sung 1 mg/L picloram và 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 5 bình tam giác (250 mL chứa 100 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,1 g mô sẹo xốp. Tất cả nghiệm thức được đặt trên máy lắc (Hermle, Ðức) với tốc độ 100 vòng/phút. Số lượng tế bào đơn được ghi nhận sau 4; 8; 12; 16; 20; 24; 28 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro

Huyền phù tế bào (0,5 mL) thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.1 được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L zeatin, 2,5 g/L gelrite, 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,5 mL thể tích huyền phù tế bào. Tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/bình, chiều cao chồi (cm), số chồi > 1,5 cm/bình và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Thí nghiệm 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi vô tính từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro

Mô sẹo thu nhận từ thí nghiệm 1.3 được cắt nhỏ (1,5 × 1,5 cm) với khối lượng khoảng 0,5 g và cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS có chứa 1 mg/L 2,4-D, 0,5 mg/L NAA, 0,2 mg/L Kin, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar [119] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 1mẫu. Số phôi/bình, số chồi, số chồi > 3 cm, khối lượng tươi (g), khối lượng khô (mg) được ghi nhận sau 14 tuần nuôi cấy.

2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro

Chồi đơn cây salem (1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 2.2 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS chứa 0,4 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar [59] và bổ sung AgNPs (0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0

mg/L), hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 8,4; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 5 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), chiều rộng lá (cm), chiều dài rễ (cm), khối

lượng tươi (g), khối lượng khô (mg), chlorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro

Chồi đơn cây dâu tây (1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 1.2 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS chứa 0,02 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 1 g/L than hoạt tính, 8,5 g/L agar [69] và bổ sung AgNPs (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L) hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 5 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), số rễ/cây, chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (mg), chlorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.

Thí nghiệm 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro

Chồi đơn cây sâm Ngọc Linh (có kích thước trung bình là 1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 2.3 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và chất lượng đồng nhất; sau đó được cấy vào môi trường SH chứa 1 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar

[117] và bổ sung AgNPs (0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L), hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 3 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), số rễ/cây, đường kính củ (cm), chiều dài củ (cm), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g), cholorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được thu nhận sau 12 tuần nuôi cấy.

2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Cây con salem (4 tuần), dâu tây (4 tuần), sâm Ngọc Linh (12 tuần) được thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất của AgNPs, FeNPs và đối chứng lần lượt ở thí nghiệm 3.1, 3.2, 3.3, rửa sạch agar bám ở rễ, trồng trong vỉ xốp với giá thể là Klasmann TS1 để đánh giá khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây con nuôi cấy in vitro ở giai đoạn ex vitro. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 100 cây ở đối tượng cây salem và dâu tây, 21 cây đối với sâm Ngọc Linh.

Thí nghiệm 4.1: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Tỷ lệ sống (%), số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), khối lượng tươi (g) và chlorophyll (nmol/cm2) được ghi nhận sau 6 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con ở điều kiện vườn ươm (6 tuần) được chuyển qua chậu nhựa (20 x 20 cm, giá thể Klasmann TS1) để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Số lượng cành, chiều cao hoa (cm), số lượng dé/cành và khối lượng tươi (g) sau 12 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm.

Thí nghiệm 4.2: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Tỷ lệ sống (%), số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), khối lượng tươi (g) và cholorophyll (nmol/cm2) được ghi nhận sau 4 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con ở điều kiện vườn ươm (4 tuần) được chuyển qua bịch ni lon (20 x 15 cm, giá thể Klasmann TS1) để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Chiều cao cây (cm), tỷ lệ đậu trái (%), số lượng ngó F1, F2, diện tích lá (cm2) và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 12 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm.

Thí nghiệm 4.3: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro