Ảnh Hưởng Của Agnps Lên Sự Gia Tăng Số Lượng Tế Bào Từ Mô Sẹo Cây Salem

bề mặt mẫu lá và có thể thay thế hoàn toàn chất khử trùng thông dụng là HgCl2 ở giai đoạn tạo nguồn mẫu in vitro. Sử dụng AgNPs nồng độ 0,2 g/L ở thời gian 20 phút cho hiệu quả khử trùng tối ưu nhất, mẫu lá cảm ứng tạo mô sẹo nhanh và phát triển tốt, không có dấu hiệu ức chế và không có ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển ở các giai đoạn sau. Đặc biệt, đây là nghiên cứu cho thấy AgNPs có thể thay thế hoàn toàn HgCl2 cũng như không sử dụng chất kháng sinh trong khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy.

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA AgNPs LÊN SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CÁC LOẠI MẪU TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

3.2.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro

AgNPs không chỉ tác động lên khả năng khử trùng và cảm ứng mẫu cấy mà trong nội dung này chúng còn ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái từ các nguồn mẫu khác nhau. Trong thí nghiệm này, bổ sung AgNPs ở các nồng độ khác nhau (0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2 mg/L) có ảnh hưởng lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem sau 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ngày nuôi cấy (Biểu đồ 3.1 và Hình 3.4).

Quá trình phát triển của các tế bào đơn từ mô sẹo cây salem trong môi trường lỏng được ghi nhận qua 4 giai đoạn (thích nghi, tăng trưởng, cân bằng, suy vong). Sau 8 ngày nuôi cấy, các tế bào đã trải qua giai đoạn thích nghi (tế bào sinh trưởng chậm) (Biểu đồ 3.1). Đặc biệt, số lượng tế bào đạt cao nhất (1623 tế bào/mL) và các tế bào có nội chất đậm đặc, bắt màu thuốc nhuộm rất đậm, các tế bào này chiếm số lượng lớn trong dịch huyền phù tế bào ở nồng độ 1,2 mg/L AgNPs (Hình 3.4d); trong khi đó, số lượng tế bào chỉ đạt 1086 tế bào/mL và các tế bào có kích thước tương đối nhỏ, đồng nhất ở đối chứng (không bổ sung AgNPs) sau 8 ngày nuôi cấy (Hình 3.4a).

50000

40000

30000

20000

10000

Thời gian

0 mg/L AgNPs

0,4 mg/L AgNPs

0,8 mg/L AgNPs

1,2 mg/L AgNPs

1,6 mg/L AgNPs

2 mg/L AgNPs

4 ngày

751

989

902

1350

1020

700

8 ngày 12 ngày 16 ngày 20 ngày 24 ngày 28 ngày

1086 3673 16337 19361 14639 12008

1251 31543 33385 34228 21321 19964

1419 35517 40463 43639 25963 22406

1623 45850 48433 49088 26294 22858

1433 39529 41909 43989 24041 21623

1299 31416 38630 43254 21611 17049

Số lượng tế bào

60000

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem sau 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ngày nuôi cấy

Hình 3.4. Huyền phù tế bào từ mô sẹo cây salem trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc

a, b, c: huyền phù tế bào trong môi trường không bổ sung AgNPs ở các giai đoạn thích nghi (ngày thứ 8), tăng trưởng (ngày thứ 16), suy vong (ngày thứ 24); d, e, f: huyền phù tế bào trong môi trường bổ sung AgNPs nồng độ 1,2 mg/L ở các giai đoạn thích nghi (ngày thứ 8), tăng trưởng (ngày thứ 16), suy vong (ngày thứ 24). Độ phóng đại: 1.000.000

Giai đoạn tăng trưởng của tế bào kéo dài từ ngày nuôi cấy thứ 8 đến ngày thứ 12 ở tất cả các nồng độ AgNPs và ngày thứ 16 ở đối chứng (Biểu đồ 3.1). Giai đoạn này, số lượng tế bào tăng lên rất nhanh và các tế bào thành cụm từ vài chục đến vài trăm tế bào. Các tế bào bắt đầu xuất hiện không bào, ban đầu là nhiều túi nhỏ, sau đó liên kết với nhau thành các túi lớn và cuối cùng thành một không bào trung tâm chiếm hầu hết thể tích của tế bào, dồn ép chất nguyên sinh và nhân ra sát thành tế bào ở đối chứng và 1,2 mg/L AgNPs (Hình 3.4b, e). Số lượng tế bào tăng rất nhanh ở nồng độ 1,2 mg/L AgNPs ngày thứ 12 (45850 tế bào/mL) so với đối chứng ngày thứ 16 (16337 tế bào/mL) (Biểu đồ 3.1). Ngoài ra, các tế bào đơn được nuôi cấy ở nồng độ 1,2 mg/L AgNPs (Hình 3.4e) có kích thước lớn hơn so với nghiệm thức đối chứng (Hình 3.4b). Giai đoạn ổn định ở các nồng độ AgNPs được bắt đầu từ ngày thứ 12, ở đối chứng là ngày thứ 16 cùng kéo dài đến ngày thứ 20. Số lượng tế bào đạt cao nhất (49088 tế bào/mL) ở nồng độ 1,2 mg/L AgNPs so với đối chứng (19361 tế bào/mL) vào ngày thứ 20 (Biểu đồ 3.1). Sau đó, số lượng tế bào giảm nhanh đến ngày thứ 24 và giảm chậm đến ngày 28, điều này chứng tỏ các tế bào bước vào giai đoạn suy vong

(Hình 3.4c, f).

Những kết quả trên cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức đều cho khả năng gia tăng số lượng tế bào; AgNPs có vai trò kích thích phân bào diễn ra nhanh hơn, làm tăng số lượng tế bào đạt mức cực đại trong thời gian ngắn và sự ổn định của tế bào trong thời gian dài. Cuối cùng là sự suy vong của tế bào diễn ra, nguyên nhân có thể là do ảnh hưởng một số yếu tố như sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, sự tăng mật độ tế bào, sự tích luỹ các chất độc. Hơn nữa các tế bào ở nồng độ 1,2 mg/L AgNPs cho sự thích nghi và tăng trưởng tốt hơn so với các nồng độ AgNPs khác và đối chứng. Điều này có thể được giải thích bằng sự liên quan giữa khí ethylene và các polyamine. Trong nghiên cứu này các polyamine không được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng lượng AgNPs bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể tác động đến hàm lượng khí ethylene làm thay đổi các polyamine; hàm lượng các polyamine thay đổi phụ thuộc vào các nồng độ AgNPs khác nhau có trong môi trường nuôi cấy. Giả thuyết này được chứng minh bằng nhiều nghiên cứu [56], [30]. Đã có nhiều minh chứng cho rằng các polyamine có vai trò quan trọng ở mức độ tế bào cũng như trong quá trình

nuôi cấy huyền phù tế bào. Heimer và cộng sự (1979) khi cho rằng các polyamine có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào (kiểu phân chia tế bào và hình thái của tế bào). Nghiên cứu này đã cho thấy sự gia tăng mức độ hoạt động của các polyamine tỷ lệ thuận với sự phân chia tế bào trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây thuốc lá (Saintpaulia ionantha) và cây cà chua (Lycopersicon esculentum) [73]. Một nghiên cứu tương tự về sự hấp thu các polyamine trên tế bào đã được thực hiện bởi Pistocchi và cộng sự (1987) thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào cây cà rốt (Daucus carota L.) [124]. Berlin và Forche đã báo cáo rằng mức độ hoạt động của các polyamine thấp đã khiến cho các tế bào thuốc lá (Saintpaulia ionantha) trong nuôi cấy ngừng phân chia nhưng các tế bào tiếp tục phát triển về kích thước theo chiều ngang; trong khi đó sự phát triển kích thước của tế bào theo chiều dọc không bị ảnh hưởng bởi các polyamine [36]. Như vậy có thể thấy các polyamine có vai trò quan trọng trong sự phân chia, sinh trưởng và phát triển hình thái tế bào.

Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên AgNPs cho thấy tác động tích cực làm gia tăng sự phát sinh huyền phù tế bào, cũng như hình thái và chất lượng tế bào cây salem thông qua con đường ức chế sinh tổng hợp của khí ethylene dẫn đến gia tăng các polyamine. Vì vậy, môi trường có bổ sung 1,2 mg/L AgNPs là tối ưu nhất cho sự phát sinh huyền phù tế bào ở ngày thứ 20; và pha cân bằng được bắt đầu từ ngày 16 đến ngày 20 vào lúc tế bào phân chia và phát triển ổn định là thời điểm thích hợp nhất cho việc cấy chuyền huyền phù tế bào.

3.2.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro

Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả ghi nhận được cho thấy việc bổ sung AgNPs ở các nồng độ khác nhau có khác biệt đáng kể về hiệu quả tái sinh chồi và chất lượng chồi so với đối chứng (không bổ sung AgNPs) (Bảng 3.4 và Hình 3.5).

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của AgNPs lện sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển chồi từ huyền phù tế bào cây salem sau 4 tuần nuôi cấy

AgNPs (mg/L)

Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)	Số chồi/bình	Chiều cao chồi (cm)	Số chồi > 1,5 cm/bình	Khối lượng tươi (g)
0,0	40,00b*	2,33c	0,90b	0,00d	0,21c
0,4	45,55ab	3,00bc	1,06b	1,33c	0,31bc
0,8	47,77ab	6,66a	1,20b	2,00bc	0,42b
1,2	59,99ab	4,00bc	1,33ab	2,33b	0,42b
1,6	67,77a	4,66b	1,83a	3,66a	0,65a
2,0	66,66a	3,66bc	1,26ab	2,33b	0,32bc

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Hình 3.5. Sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển chồi từ huyền phù tế bào cây salem ở đối chứng và các nồng độ AgNPs khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

a, b, c, d, e, f: chồi cây salem từ môi trường bổ sung các nồng độ AgNPs khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; từ trái qua phải) sau 4 tuần nuôi cấy.

Kết quả ghi nhận sự hình thành mô sẹo xốp có cấu trúc giống phôi ở tất cả các nồng độ AgNPs và đối chứng (không có bổ sung AgNPs) sau 1 tuần nuôi cấy; trong khi đó, sự tái sinh chồi được ghi nhận ở tuần thứ 2 ở các nồng độ AgNPs so với đối chứng là tuần thứ 3. Như vậy, quá trình tái sinh chồi cây salem từ huyền phù tế bào là gián tiếp thông qua mô sẹo có cấu trúc giống phôi và AgNPs có vai trò trong quá trình thúc đẩy sự tái sinh chồi diễn ra nhanh hơn so với đối chứng.

Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả ghi nhận cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi đạt tối ưu ở các nồng độ AgNPs (45,55 – 67,77%) so với đối chứng (40,00%). Số chồi/bình đạt cao nhất ở 0,8 mg/L AgNPs (6,66 chồi); cao gần gấp 3 lần so với đối chứng (2,33 chồi). Bên cạnh đó, chiều cao chồi đạt tối ưu ở 1,2 – 2,0 mg/L AgNPs (1,26 – 1,83 cm) so với các nồng độ AgNPs khác và đối chứng (0,90 – 1,20 cm). Đặc biệt, số chồi

lớn hơn 1,5 cm và khối lượng tươi đạt cao nhất ở 1,6 mg/L AgNPs (lần lượt là 3,66 chồi, 0,56 g) so với đối chứng (lần lượt là 0,00 chồi, 0,21 g).

Bên cạnh đó, kết quả ghi nhận ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs và đối chứng cho thấy sự tái sinh chồi yếu (Hình 3.5a, b). Các chồi hình thành ở nồng độ 0,8 – 1,2 mg/L AgNPs có sự phân nhánh khá cao, từ một chồi hình thành thêm 2 – 3 chồi khác (Hình 3.5c, d) làm cho hình thái chồi có hình dạng không bình thường, dễ bị tổn thương khi cấy chuyền. Những chồi ở nồng độ 1,6 mg/L AgNPs có sự hình thành chồi đơn rõ ràng, các chồi to, khoẻ, tách nhau ra riêng biệt, và đây là nguồn vật liệu tốt cho quá trình vi nhân giống (Hình 3.5e). Ở nồng độ 2,0 mg/L AgNPs gây ức chế sự phát triển chồi, sự hình thành chồi vẫn xảy ra sớm nhưng các chồi chậm phát triển ở những tuần tiếp theo (Hình 3.5f).

Hiện tượng tái sinh chồi từ huyền phù tế bào đã được Skoog và Miller (1957) mô tả thông qua các giai đoạn như sau: từ dịch huyền phù tế bào hình thành mô sẹo có cấu trúc giống phôi, từ các mô sẹo này hình thành chồi, từ chồi hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh; tất cả những quá trình này phụ thuộc rất nhiều vào các chất điều hoà sinh trưởng thực vật [146]. Trong nghiên cứu này, sự hình thành chồi cây salem cũng được tái sinh thông qua mô sẹo có cấu trúc giống phôi. Kết quả cho thấy AgNPs ở nồng độ tối ưu (1,6 mg/L) trong thí nghiệm này không chỉ có tác dụng thúc đẩy quá trình tái sinh chồi cây salem mà còn có vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của chúng trong nuôi cấy in vitro. Nếu tăng hoặc giảm nồng độ AgNPs trong môi trường nuôi cấy, kết quả ghi nhận các chỉ tiêu này cũng giảm theo.

Như vậy, trong môi trường có bổ sung 1,6 mg/L AgNPs cho sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển chồi cây salem cao sau 4 tuần nuôi cấy in vitro.

3.2.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro

Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy số lượng phôi và cây con có nguồn gốc từ phôi phụ thuộc vào nồng độ AgNPs được bổ sung vào môi trường sau 14 tuần nuôi cấy. Số lượng phôi soma (140) và cây con có nguồn gốc từ phôi (14,66) ở nồng độ 1,6 mg/L AgNPs cao hơn đáng kể 3-4 lần so với ở nghiệm thức đối chứng (lần lượt là 40,33; 4,33;). Bên cạnh đó, hình thái phôi cũng được ghi nhận ở nồng độ 1,6 mg/L

AgNPs là phôi hình cầu, hình tim, hình ngư lôi, lá mầm (Hình 3.6a, b, c và Hình 3.7) với bề mặt nhẵn, nằm cách xa nhau; trong khi đó chỉ các phôi hình cầu, kết dính được ghi nhận trong đối chứng.

Số lượng cây con có nguồn gốc từ phôi > 3cm và khối lượng tươi của cây con đạt tối ưu ở nồng độ AgNPs từ 0,8 mg/L đến 1,6 mg/L (Hình 3.6d). Trong đó, khối lượng tươi của cây con ở nghiệm thức bổ sung AgNPs ở 0,8 mg/L (0,63 g) và 1,2 mg/L (0,56 g) cao hơn hẳn ở 1,6 mg/L AgNPs (0,48 g), nhưng khối lượng khô thấp hơn đáng kể (56,33 mg và 62,00 mg) so với nghiệm thức bổ sung 1,6 mg/L AgNPs (86,00 mg). Do đó, cây con trong nghiệm thức bổ sung 0,8 mg/L và 1,2 mg/L AgNPs cho thấy hiện tượng thủy tinh thể. Mặt khác, các thông số trong xử lý bổ sung 2,0 mg/L AgNPs không chỉ cho thấy sự ức chế sự hình thành phôi mới mà còn có tác động tiêu cực đến sự phát triển của cây con có nguồn gốc từ phôi.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng nhân nhanh phôi và tái sinh chồi từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy

Cây con có nguồn

			3 cm/bình
0,0	40,33c*	4,33d	2,66c	0,28c	28,66d
0,4	49,33c	9,33b	4,00bc	0,35bc	43,33bcd
0,8	83,66b	9,66b	5,00ab	0,63a	56,33bc
1,2	98,33b	10,66b	5,33ab	0,56ab	62,00b
1,6	140,00a	14,66a	5,66a	0,48abc	86,00a
2,0	40,66c	6,66c	0,00d	0,31bc	41,00cd

AgNPs Số

gốc từ phôi Khối lượng

Khối lượng

(mg/L)

phôi/ bình

Tổng

Cây con >

tươi cây con (g)

khô cây con (mg)

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình sinh và tăng sinh phôi soma sâm Ngọc Linh sau 14 nuần nuôi cấy

a. và b. Phôi soma được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang và phôi hình cầu trên bề mặt mô sẹo được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại là 1.000.000 trên môi trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau 6 tuần nuôi cấy, c. Phôi soma lấy bằng kính hiển vi huỳnh quang trên môi trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau 8 tuần nuôi cấy,

d. Phôi soma và cây con trên môi trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau 14 tuần nuôi cấy.