Sơ Đồ Các Bước Thí Nghiệm Thực Hiện Trong Luận Án

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

- Các mẫu nước và bùn được thu thập ở một số vùng biển bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam bao gồm: Quảng Ninh, Thanh Hóa, Bình Định, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Vũng Tàu, … Mẫu được lưu trữ trong ống falcon 50ml tiệt trùng và được lưu trữ trong một hộp đựng nước đá trong thời gian vận chuyển, sau đó duy trì ở nhiệt độ 4oC ở Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong vòng 24 giờ để phân tích. Dầu diesel và dầu thô được lấy từ giếng dầu Bạch Hổ (Vũng Tàu).

- 17 chủng VKTQH ban đầu đã được chọn từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh học môi trường, đó là: QP21, HQP304, DG12, DG217, LACM1, NMS25, DG218, LACM2I2, DG114, DG211, NMS411, VH, NMS412, DG213, MI1,

A3II3 và DG214 được phân lập từ nước và trầm tích của những nguồn thải ở một số nhà máy và cơ sở sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc như: Nhà máy Sơn Cầu Diễn, Hà Nội; Nhà máy Hóa chất Đức Giang và Công ty Xăng dầu khu vực I, Gia Lâm, Hà Nội; Cảng B12, Hạ Long, Quảng Ninh; Kho Vũ khí Bộ Quốc phòng; Nông trường Đồng Giao, Ninh Bình. Chủng MI1 đã được phân loại, thuộc chi Rhodopseudomonas và đặt tên là Rhodopseudomonas sp. MI1.

- Chủng Acinetobacter calcoacetius P23 có khả năng tạo màng sinh học tốt được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Đại học Hokkaido, Nhật Bản được sử dụng làm đối chứng dương cho khả năng tạo màng sinh học [124].

- Trình tự nucleotide của cặp mồi dùng khuếch đại đặc hiệu cho đoạn 16S rRNA Ramana và cộng sự đã sử dụng [125]:

27f primer: (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')

1527r primer: (5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′).

- Các chủng nghiên cứu trong luận án đều được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ tối ưu 30 ± 2oC. Trong đó, công thức môi trường được sử dụng là DSMZ

27. Quy trình nuôi vi khuẩn được theo dõi dưới ánh đèn sợi đốt có công suất 60W với khoảng cách 20 cm.

- Giá thể: Vật liệu được chọn để làm giá thể cố định VKTQH dựa trên các điều kiện cơ bản như khả năng hấp phụ chất ô nhiễm, đồng thời cũng có các khoảng trống để VKTQH có khả năng cố định và phát triển trên đó. Từ các cơ sở trên, một số vật liệu có thể đáp ứng các điều kiện phù hợp với các VKTQH tạo màng sinh học cũng như điều kiện phòng thí nghiệm trong nghiên cứu này bao gồm ba loại là: xơ dừa, sỏi nhẹ và mút xốp (Bảng 2.1.)

Bảng 2.1. Các loại giá thể

Giá thể

Hình ảnh	Thông số kỹ thuật	Hãng sản xuất
Mút PU K40 (Polyurethane)		- Quy cách: Dạng tấm - Trọng lượng riêng: 40kg/m3	Công ty cổ phần Đại Thành
Sỏi nhẹ Keramzite		- Cỡ hạt: 10- 20mm - Trọng lượng riêng: 650 kg/m3	Bemes
Xơ dừa		- Quy cách: dạng tấm - Trọng lượng riêng: 125kg/ m3	Công ty cổ phần sản xuất chế biến chỉ xơ dừa 25/8

Có thể bạn quan tâm!

• Định Vị Sắc Tố Quang Hợp Trong Tế Bào Vi Khuẩn Tía Quang Hợp
• Ứng Dụng Của Vi Khuẩn Tía Quang Hợp Để Phân Hủy Hydrocarbon Dầu Mỏ
• Ứng Dụng Vi Khuẩn Tía Quang Hợp Để Phân Hủy Hydrocarbon Dầu Mỏ
• Phương Pháp Nghiên Cứu Hệ Sắc Tố Của Vi Khuẩn Tía Quang Hợp
• Kết Quả Phân Lập Các Khuẩn Lạc Vktqh Từ Nguồn Mẫu Nước Bị Ô Nhiễm Dầu Mỏ Ở Các Vùng Biển Việt Nam
• Khả Năng Sinh Trưởng Của 10 Chủng Vktqh Ở Các Nồng Độ Naphthalene Khác Nhau Sau 7 Ngày Nuôi Cấy

Xem toàn bộ 144 trang tài liệu này.

2.1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy

 Hóa chất: Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất tinh khiết được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như: Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic, v.v...

- Chuẩn bị cơ chất:

+ Các hợp chất hydrocarbon thơm hầu như đều ít tan trong nước, được pha trong acetone, bảo quản trong lọ tối màu và bảo quản trong tối, tránh ánh sáng mặt trời.

o Stock toluene 10.000 ppm: pha 200 μl toluene trong 20 ml acetone.

o Stock phenol 50.000 ppm: pha 0,5 ml phenol trong 9,5 ml acetone.

o Stock naphthalene 50.000 ppm: pha 0,5 g naphthalene trong 10 ml acetone.

o Stock pyrene 50.000 ppm: cân 0,5g pyrene hòa tan trong 10 ml acetone.

+ Dầu diesel, dầu thô nguyên chất được xử lý sơ bộ qua giấy lọc có kích thước lỗ 8 μm, hãng sản xuất Whatman – Anh.

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường DSMZ 27 ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18-20 g/l) được dung để để phân lập, nuôi cấy và giữ giống [126]. Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.

- Dung dịch vi lượng SL6(mg/l) [127]: H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03g; CoCl2.6H2O 0,2g; ZnSO4.7H2O 0,1 g; CuCl2.2H2O 0,01 g; NiCl2.6H2O 0,02 g; NaMoO4.2H2O 0,03 g.

- Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 8 μm và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng (tỷ lệ 0,4 ml/l).

- Môi trường DSMZ 27 cải tiến là môi trường DSMZ 27 trong đó nguồn carbon được thay thế bằng các nguồn hydrocarbon khác nhau như phenol, naphthalene, pyrene, toluene ở nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 và 300 ppm.

2.1.3. Các thiết bị máy móc

TT

Tên thiết bị	TT	Tên thiết bị
1.	Bình khí nitơ (Nga)	8.	Tủ lạnh Samsung (Nhật Bản)
2.	Bóng đèn sợi đốt Rạng Đông 60w	9.	Tủ cấy vô trùng AVC-4A1(Esco, Singapore)
3.	Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ)	10.	Máy đo quang phổ NOVASPEC II (Anh)
4.	Nồi khử trùng ướt (Trung Quốc)	11.	Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản)
5.	Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ)	12.	Kính hiển vi điện tử SEM, JSM- 840, Nhật Bản.
6.	Máy điện di Powerpac 300 (Bio- Rad, Mỹ)	13.	Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ)
7.	Máy hút chân không Speed- Vac 110A (Savant, Mỹ)	14.	Máy ly tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi)

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Trong khuôn khổ của luận án này, các phương pháp phân tích VSV kết hợp với sinh học phân tử đã được sử dụng. Sơ đồ các bước thí nghiệm được thể hiện ở Hình 2.2.

Thu thập mẫu

Làm giàu và phân lập VKTQH có khả năng sử dụng các hydrocarbon dầu mỏ như nguồn carbon và năng lượng duy nhất

Sàng lọc các chủng VKTQH sinh trưởng trên môi trường DSMZ 27 và tạo màng sinh học tốt

Lựa chọn các chủng có khả năng tạo màng sinh học và sử dụng

hydrocarbon dầu mỏ tốt

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và

phân loại bằng so sánh trình tự 16SrDNA

Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lý, hóa tới khả năng tạo MSH

Đánh giá hiệu suất phân hủy dầu diesel, PAH, dầu thô bởi MSH đơn chủng, đa chủng VKTQH không gắn giá thể hoặc trên giá thể (xơ dừa, sỏi nhẹ, mút xốp) thực hiện trên mô hình.

Hình 2.2. Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án

2.2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật

2.2.1.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu ở một số vùng biển bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam như: Quảng Ninh, Thanh Hóa, Bình Định, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Vũng Tàu, … theo TCVN 6663-1:2011 (ISO 5667-1:2006) và TCVN 7538-2:2005 (ISO 10381-

2:2002) có chỉnh sửa. Cụ thể, các bước lấy mẫu nước được tiến hành vào buổi sáng, nhiệt độ dao động từ 25-32oC. Mẫu nước sau khi thu thập được bảo quản trong ống falcon 50 ml, ghi thông tin đầy đủ và lưu trữ ở 4oC trong vòng 24 giờ để phân tích.

2.2.1.2. Phương pháp làm giàu các chủng vi khuẩn tía quang hợp

Vi khuẩn tía quang hợp trong các mẫu đã được làm giàu theo phương pháp của Yamanaka và cộng sự (1983) có cải tiến, cụ thể: nuôi tích lũy trong các chai nhựa trong hình trụ có kích thước Ф = 5 cm, h = 35 cm. Các chai nhựa này được thiết kế theo kiểu cột Winogradsky. Các mẫu nước và bùn được đưa vào chai với tỷ lệ 1:1 (đối với các mẫu nước) hoặc 9: 1 (đối với các mẫu bùn) với thể tích môi trường DSMZ 27. Dầu diesel, naphthalene, pyrene hoặc anthracene (100 ppm) được bổ sung làm cơ chất, sau đó đậy kín để hạn chế sự có mặt của oxy (kỵ khí) và đặt dưới ánh đèn sợi đốt có công suất 60W (tương đương 5000 Lux), giữ ở nhiệt độ 30±2oC. Sau khoảng một tuần, các vạch màu từ nâu đến đỏ tía xuất hiên trên thành bình (là biểu hiện có sắc tố đặc trưng của VKTQH). Lấy mẫu từ vạch rồi tiến hành phân lập trên trên đĩa petri chứa môi trường thạch DSMZ 27.

2.2.1.3. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn tía quang hợp

Phân lập các chủng vi khuẩn tía quang hợp được tiến hành theo phương pháp pha loãng dải nồng độ và cấy chang trên đĩa thạch [128]. Dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 đến 10-10, lấy dịch pha loãng ở 10-3 – 10-6 cấy chang trên môi trường thạch DSMZ 27 (agar 2%) có bổ sung các hydrocarbon dầu mỏ nồng độ 50 - 300 ppm tương ứng với giai đoạn làm giàu. Các đĩa thạch được ghi rõ thông tin, sau đó nuôi trong điều kiện nhiệt độ tối ưu 30±2oC, ánh sáng tương đương 5000 Lux từ đèn sợi đốt, sau 2 ngày nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc tròn có màu nâu, hồng đến đỏ tía. Các khuẩn lạc này được làm sạch theo phương pháp cấy ria và tiến hành ủ mẫu dưới điều kiện kỵ khí sáng. Các chủng VKTQH đã được làm sạch được bảo quản ở -20oC trong glycerol lỏng [20% (v/v)] phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.1.4. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp

Sinh trưởng của các chủng VKTQH đặc đánh giá bằng cách quan sát độ lớn khuẩn lạc khi mọc trên đĩa thạch hoặc xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 800 nm (OD800) [129], vì trong tế bào vi khuẩn tía quang hợp Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỉ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỉ lệ thuận với sinh khối tế bào. Các chỉ số này được đo trên máy quang phổ Novaspec II hoặc máy quang phổ UV – 1650PC.

2.2.1.5. Phương pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp

Để đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng đã lựa chọn, tiến hành nhuộm với tím tinh thể theo phương pháp của O’Toole và Kolter (1998), Morikawa (2006) và có cải tiến [130, 131]. Phương pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong một màng sinh học trên bề mặt giá thể đồng thời cũng cho phép định lượng mức độ hình thành màng sinh học mạnh hay yếu trong một khoảng thời gian nhất định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng OD570. Chỉ số OD570 đo lượng tím tinh thể được giữ trong màng sinh học tỷ lệ thuận với mật độ tế bào sống trong màng sinh học.

Đối với PNSB một số bước được thay đổi như sau:

- Hoạt hóa các chủng làm màng sinh học: Nuôi cấy các chủng trên môi trường DSMZ 27 dịch. Sau từ 3-5 ngày nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4000 vòng/phút 4oC trong vòng 10 phút và rửa nước cất 2 lần với thể tích tương ứng). Sau lần ly tâm cuối cùng và hòa sinh khối trong 400 μl nước cất vô trùng. Pha loãng dịch sinh khối bằng nước cất vô trùng để đạt OD là 0,3. Bổ sung 100 μl dịch này vào các ống eppendorf 1,5 ml chứa 900 μl môi trường DSMZ 27. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các mẫu được nuôi tĩnh dưới bóng đèn sợi đốt 60W và đánh giá khả năng tạo màng sinh học sau 7 ngày.

- Kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi sinh vật:

Dùng pipetman hút dịch nuôi cấy nhẹ không làm vỡ màng, rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 1 ml nước cất, hút loại nước, lặp lại lần nữa. Cho 1 ml dung dịch tím tinh thể 0,1 % vào các ống eppendorf, ủ 10 phút để cố định ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch tím tinh thể, rửa bằng 1 ml nước cất (2 lần). Bổ sung 1 ml dung dịch

axit axetic 33 %, đảo trộn hỗn hợp này, pha loãng tới hạn và đo OD ở bước sóng 600 nm. Các chủng VKTQH có chứa các sắc tố bacteriochlorophyll, vì vậy, bước sóng được sử dụng có sự thay đổi, không phải là 570 nm như trong các tài liệu [130, 131].

Công thức tính giá trị màng tạo thành:

Y = X x độ pha loãng x 10/3 Trong đó, X: là giá trị đo OD thu được;

10/3: là chỉ số quy đổi từ giá trị OD sang giá trị hấp thụ tím tinh thể của màng tạo thành).

Thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm.

Chủng A. calcoacetius P23 được sử dụng làm đối chứng dương, ống eppendorf không chứa sinh khối VSV được chọn làm đối chứng âm [124].

2.2.1.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp trên một số nguồn hydrocarbon khác nhau

VKTQH được đánh giá khả năng sinh trưởng trên một số nguồn hydrocarbon dầu mỏ, bao gồm toluene, naphthalene, phenol, pyrene và dầu diesel được bổ sung thay thế cho acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 theo quy trình sau [79]:

- Các chủng vi khuẩn tía quang hợp đã hoạt hóa trong môi trường DSMZ 27 từ 3 – 5 ngày.

- Bổ sung 1 ml dịch sinh khối của mỗi chủng vào các ống penicillin (dung tích 12 ml) có chứa 9 ml môi trường DSMZ 27 cải tiến, nguồn cơ chất (tùy thí nghiệm) ở nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 và 300 ppm; 4%-10% (dầu diesel). Các ống penicillin được đậy nút cao su kín, giữ bằng gông sắt và được đặt dưới ánh đèn sợi đốt (nhiệt độ 30±2oC, ánh sáng khoảng 5000 lux). Định kỳ mỗi ngày lắc nhẹ ống để cơ chất được phân bổ đều trong dịch nuôi cấy. Đối chứng là các ống penicillin chỉ chứa môi trường DSMZ 27 cải tiến bổ sung nguồn cơ chất.

- Dịch sinh khối thu được sau 7 ngày nuôi cấy được đo bằng máy quang phổ kế với bước sóng 800 nm để theo dõi mật độ tế bào.

2.2.1.7. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của của các chủng vi khuẩn tía quang hợp

Nhuộm Gram

Xác định Gram của vi khuẩn theo phương pháp của Smith và Hussey [132], sử dụng chủng vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Bacillus subtillis làm đối chứng.

Phương pháp xác định hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét

Hình thái hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét với sự phối hợp của phòng Vi sinh vật – Viện dịch tễ Trung ương, Hà Nội.

- Xác định hình thái tế bào của chủng VKTQH

Các chủng VKTQH được nuôi cấy trên môi trường DSMZ 27 thạch. Sau 2 ngày, lấy sinh khối tế bào cho vào ống eppendorf có chứa dung dịch cacodylate 0,1 M, đánh tan rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút (2-3 lần). Cố định mẫu trong đĩa 6 giếng vô trùng bằng 2,5-3% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4 trong 1 giờ và rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/ lần x 3 lần). Tiếp đó mẫu được cố định mẫu bằng OsO4 1% trong cacodylate 0,1 M trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa lại bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/lần x 2 lần). Hút nước trong mẫu bằng cồn các nồng độ 50o, 70o, 80o, 90o, 100oC (5 phút/lần x 2 lần). Gắn mẫu trên giấy bạc, để khô, phủ mẫu bằng một lớp dẫn điện Pt – Pd và soi mẫu, chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử SEM, JSM-840, Nhật Bản.

- Xác định hình thái tế bào của các màng sinh học

Màng sinh học được chuyển lên tấm lamen có kích thước 1 cm2 (đã được nhỏ poly-L-lysine 0,1% (w/v) để cố định màng sinh học). Cố định mẫu trong đĩa 6 giếng vô trùng bằng 2,5-3% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4 trong 1 giờ và rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/ lần x 3 lần). Thực hiện các bước thí nghiệm tương tự khi xác định hình thái tế bào của các chủng VKTQH ở trên.

2.2.1.8. Đánh giá mật độ tế bào của vi khuẩn tía quang hợp

Xác định mật độ tế bào VKTQH ở dạng tự do

Mật độ tế bào được xác định theo phương pháp pha loãng và cấy gạt trên môi trường thạch như sau: mẫu được pha loãng liên tục bằng nước cất vô trùng từ 10-1 đến 10-10. Dùng pipet vô trùng lấy 50 µl dung dịch ở các nồng độ pha loãng thích