Phân Lập Và Định Danh Vi Khuẩn (Frerichs Và Millar (1983, 1993))

gây nhiễm thực nghiệm trong phòng thí nghiệm với dịch lọc của tôm nhiễm bệnh đã không xác định được tác nhân vi rút, hay tác nhân truyền nhiễm khác hay độc tố. Phân tích mô học cho thấy tôm bị AHPND có thể gây ra bởi độc tố (Lightner và cộng sự, 2012). Độc tố có thể từ môi trường nước, thức ăn hoặc từ vi khuẩn. Mặc dù vậy, phân tích thức ăn dùng cho tôm và thuốc diệt giáp xác bao gồm Cypermethrin đã không thể hiện các dấu hiệu đặc trưng của AHPND.

Bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) cũng có nhận định ban đầu một số tác nhân vi rút thường gặp như WSSV, YHV, IMNV và TSV không phải là tác nhân gây AHPND. Bên cạnh đó, theo kết quả phân tích mẫu tôm bệnh được thực hiện bởi Cơ quan Thú y vùng VI cho thấy sự hiện diện của WSSV (30% mẫu thu ở Tiền Giang), IHHNV (30-40% mẫu thu ở Bến Tre và Tiền Giang), không phát hiện thấy sự có mặt của WSSV, YHV và TSV.Kết quả xét nghiệm của trường Đại học Cần Thơ trên mẫu tôm thu tại Kiên Giang cho thấy có dấu hiệu nhiễm NHP đồng thời có sự xuất hiện của IMNV và TSV. Kết quả phân tích của Viện NCNTTS 2 trên mẫu tôm thu tại Sóc Trăng, Bạc Liêu cho thấy tỷ lệ nhiễm WSSV và YHV không quá 15%, MBV xuất hiện với tỷ lệ 20-30%, IHHNV khoảng 30%. Những kết quả phân tích này cho thấy tác nhân gây bệnh không phải là những vi rút gây bệnh tôm đã từng được công bố như WSSV, YHV, TSV, IHHNS, MBV, HPV và IMNV.

Kết quả kiểm tra sự hiện diện của vi bào tử trùng bằng 04 quy trình phản ứng PCR dựa trên các cặp mồi được công bố bởi OIE và các bài báo quốc tế đều cho kết quả âm tính. Đồng thời, kiểm tra sự hiện diện của NHP bằng phương pháp PCR cũng cho kết quả âm tính.

Ngoài ra, cũng có một vài nghiên cứu trước có liên quan đến bệnh gan tụy trên tôm như nghiên cứu bệnh phân trắng, teo gan trên tôm sú nuôi thương phẩm tại Ninh Thuận (Nguyễn Khắc Lâm, 2004; Nguyễn Khắc Lâm và Đỗ Thị Hòa, 2007). Trong những nghiên cứu này cũng ghi nhận các biến đổi trên gan tụy tôm

như teo hoặc nhũn. Tác nhân gây bệnh được xác định có liên quan đến HPV, nguyên sinh động vật (Gregarin) và vi khuẩn thuộc giống Vibrio. Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2008) về bệnh phân trắng ở tôm cũng có nhắc đến dấu hiệu “teo gan” trên tôm nuôi ở Đồng bằng song Cửu Long. Thực tế là các nghiên cứu đều chưa chỉ ra được tác nhân cụ thể.

Tuy nhiên theo đề tài nghiên cứu xác định nguyên nhân bệnh hoại tử trên tôm tại phía Bắc của Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, (2012), phát hiện nhiều vi khuẩn ở tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy ở tất cả các vùng nuôi tôm, trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là các loài V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus.

Nghiên cứu khả năng lây nhiễm hội chứng hoại tử gan tuỵ ở tôm, một loạt các thực nghiệm cảm nhiễm bệnh đã được tiến hành. Tôm giống khoẻ được thí nghiệm lây nhiễm thông qua nuôi chung với tôm bệnh, cho ăn thức ăn có trộn gan tuỵ thu từ tôm bệnh, ngâm tôm trong môi trường có gan tuỵ thu từ tôm bệnh, tiêm dịch chiết gan tuỵ tôm bệnh. Các thực nghiệm đã được tiến hành ở các nồng độ gây nhiễm khác nhau, thời gian khác nhau. Kết quả cho thấy, có hiện tượng lây nhiễm xảy ra ở tôm thí nghiệm, tuy nhiên mức độ lây nhiễm không cao, dường như mức độ lây nhiễm phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy khi được chuyển tới môi trường nước sạch đã giảm tỷ lệ chết, có khả năng phục hồi.

Tháng 5 năm 2013, nhóm nghiên cứu do Giáo sư Donald Lightner thuộc Đại học Arizona (Mỹ) đứng đầu xác định một dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, khi bị nhiễm virus được gọi là thực khuẩn thể (Phase) sẽ tạo ra độc tố cực mạnh, tương tự hiện tượng bệnh dịch tả ở người, là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tuy cấp (AHNPD).

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tôm sú và Tôm thẻ chân trắng

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND

- Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực

- Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Thực hiện từ ngày 4/2013 đến tháng 4/2014

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: Nghệ An và Nam Định

- Địa điểm phân tích mẫu bệnh: Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Bắc – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định AHPND

- Dấu hiệu lâm sàng (Cục Thú y, 2012):

o Hội chứng gan tụy cấp gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng ở

giai đoạn 15-45 ngày tuổi sau khi thả nuôi.

o Tôm bệnh biểu hiện các dấu hiệu như ngừng ăn, bơi chậm, vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt, và gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo.

- Kỹ thuật mô bệnh học (Lightner, 1996)

Các bước trình tự theo sơ đồ sau:

Lấy mẫu:

Cố định bằng dung dịch Davison (12-72h) Chuyển sang cồn 700C để bảo quản

Xử lý mẫu

Cắt mẫu 0,2-0,5cm cho vào trong cassette Xử lý bằng máy xử lý mẫu tự động

Đúc và cắt mẫu

Đúc mẫu: Đổ parafin và tạo khuôn Cắt mẫu: máy cắt microtom

Nhuộm màu

Hematocyline-Mayer và Eosin.

Đọc kết quả

Quan sát kính hiển vi

Bước1: Lấy mẫu

+ Đối với tôm Post

Ngâm toàn bộ con tôm trực tiếp trong dung dịch cố định với tỉ lệ mẫu/dung dịch cố định là 1/10 trong vòng 12-24h.

+ Đối với tôm lớn hơn

Dùng kéo cắt và tách lớp vỏ giáp ở phần đầu ngực để có thể lấy được các nội quan. Với những cơ quan có kích thước nhỏ chỉ cần dùng kéo và panh

tách ra rồi bỏ vào chai đựng dung dịch cố định Davidson, với những cơ quan có kích thước lớn, dùng xilanh tiêm dung dịch cố định vào mô của cơ quan đó rồi mới bỏ vào dung dịch cố định Davidson. Để dung dịch cố định ngấm tốt vào các tổ chức mô nên dùng tỉ lệ giữa thể tích tôm và dung dịch cố định là 1/10. Giữ mẫu trong dung dịch cố định 12-72h.

Tất cả các mẫu thu đều phải được ghi nhãn về thông tin mẫu đầy đủ, sau giữ trong dung dịch cố định 12-72h (tùy mẫu) sẽ được chuyển sang dung dịch cồn 70 độ để bảo quản.

Bước 2: Xử lý mẫu:

+ Chuẩn bị mẫu để xử lý: Dùng panh gắp mẫu ra khỏi lọ đựng dung dịch bảo quản mẫu, sau đó lấy dao sắc cắt mẫu thành những miếng có kích thước từ 0,2 – 0,5cm cho vào trong cassette.

+ Qui trình xử lý mẫu: xử lý bằng máy xử lý mẫu tự động (xếp cassette có chứa mẫu vào giỏ đựng mẫu và cho vào máy xử lý tự động).

Bước 3: Đúc và cắt mẫu:

+ Đúc mẫu: Sử dụng máy để đổ parafin đã nóng chảy vào khuôn đã có mẫu, sau đó đặt khuôn lên dàn lạnh, sau ít phút có thể tạo ra các khuôn có chứa mẫu. Dùng dao gọt và cắt mẫu thành các khối hình thang cân hoặc hình chữ nhật.

+ Cắt mẫu: Gắn cassette có mẫu đã được gọt vào máy cắt microtom, cắt lát có độ dày 5µm. Đưa lát cắt vào nước ẩm (40-50oC) (có thể bỏ thêm lòng trắng trứng gà) khoảng 1-2 phút để lát cắt giãn, không bị nhăn. Dùng lam sạch để lấy lát cắt ra khỏi nước, đặt lên máy sấy ở nhiệt độ 45-60oC trong 1-4h

Bước 4: Nhuộm màu

Mẫu sau khi sấy sẽ được xếp vào trong các giỏ nhuộm và mang nhuộm màu. Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm màu truyền thống bằng thuốc nhuộm Hematocyline-Mayer và Eosin.

Bước 5: Đọc kết quả:

Dựa vào các dấu hiệu sau để xác định AHPND (Cục Thú y, 2012)

o Thoái hóa cấp gan tụy;

o Thiếu hoạt động phân bào đẳng nhiễm của tế bào có nguồn gốc từ mô phôi (tế bào E, Embryonalzellen);

o Rối loạn chức năng các tế bào trung tâm tổ chức gan tụy: tế bào tiết B (Basenzellen), tế bào xơ F (Fibrillenzellen), tế bào dự trữ R (Restzellen);

o Các tế bào gan tụy có nhân lớn bất thường và sự bong tróc tế bào.

o Ở giai đoạn cuối các tế bào máu tập hợp giữa các ống gan tụy và nhiễm khuẩn

2.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn (Frerichs và Millar (1983, 1993))

c như sau:

Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc Nuôi cấy trên môi trường cơ bản (Nu+) Kiểm tra hình thái khuẩn lạc (sau 24h)

Nuôi cấy vi khuẩn thuần chủng

Cấy chuyển sang môi trường TCBS

Tóm tắt các bướ

Học viện Nông nghiệp

Page 30

Nhuộm vi khuẩn thuần chủng:

Nhuộm Gram Soi kính 10-40-100

Thử phản ứng sinh hóa

Bằng bộ Kit API 20E

Bước 1: Kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Sau khi lấy mẫu bệnh phẩm tôm bệnh, nuôi cấy trên môi trường cơ bản (Nutrient Agar), ở nhiệt độ 28 – 300C, sau 24 giờ kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc (kích thước khuẩn lạc, hình thái khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc).

Bước 2: Nuôi cấy vi khuẩn thuần chủng: Sau khi kiểm tra đặc điểm, hình thái khuẩn lạc, đánh dấu các khuẩn lạc rời mà mọc trên đường cấy, dùng que cấy đã vô trùng lấy khuẩn lạc đã đánh dấu, cấy chuyển sang đĩa môi trường chọn lọc TCBS và để mẫu ở nhiệt độ 28 – 300C.

Bước 3: Nhuộm vi khuẩn thuần chủng: Lấy khuẩn lạc thuần chủng, dàn mỏng trên lam với 1 giọt nước muối sinh lý 2%, hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn nhằm cố định vi khuẩn và tiến hành nhuôm gram và soi vi khuẩn bằng kính hiển vi từ vật kính 10 - 40 - 100 để quan sát hình dạng và màu sắc của vi khuẩn.

Bước 4: Thử các phản ứng sinh hóa bằng bộ Kit API 20E (BioMerieux, Pháp):

Bảng 2.1: Cách thực hiện và đọc các phản ứng sinh hóa

Tests

Cách nhỏ dung dịch huyền phù vào các giếng	Đọc kết quả
Cách nhỏ dung dịch huyền phù vào các giếng	Dương tính	Âm tính
ONPG	Nhỏ lên tới miệng	Màu vàng	Không màu
ADH	Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu parafin đã vô trùng.	Màu đỏ hay cam	Vàng
LDC	Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu parafin đã vô trùng.	Màu đỏ hay cam	Vàng
ODC	Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu parafin đã vô trùng.	Màu đỏ hay cam	Vàng
CIT	Nhỏ đầy	Xanh bule hay green	Vàng hay hơi xanh
H2S	Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu parafin đã vô trùng.	Đen hay có vẩn đen đục	Trắng hoặc xám
URE	Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu parafin đã vô trùng.	Màu đỏ hay cam	Vàng
TDA	Nhỏ lên tới miệng. Khi đọc nhỏ 1 giọt TDA rồi đọc kết quả ngay .	Nâu đỏ	Vàng
IND	Nhỏ lên tới miệng. Khi đọc nhỏ 1 giọt Jame rồi đọc kq ngay	Trắng hay vàng	Hồng
VP	Nhỏ đầy. Khi đọc nhỏ 1 giọt VP1 và 1 giọt VP2 đọc kết quả sau 10 phút	Trắng hay hơi hồng	Hồng hay đỏ
GEL	Nhỏ đầy	Có sự khuếch tán màu đen	Không có sự khuếch tán
GLU	Nhỏ lên tới miệng.	Vàng hay hơi xám vàng	Xanh
MAN	Nhỏ lên tới miệng	Vàng	Xanh
INO	Nhỏ lên tới miệng	Vàng	Xanh
SOR	Nhỏ lên tới miệng	Vàng	Xanh
RHA	Nhỏ lên tới miệng	Vàng	Xanh