Hình 4.8 Đồ thị nồng độ lysozyme chuẩn
4.3.1 Hàm lượng lysozyme trước cảm nhiễm
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng lysozyme trung bình trong máu cá sau khi cho ăn hoàng kỳ 5 tuần tương đối cao và dao động từ 26,43 ± 1,21 µ g/ml đến 29,65
± 1,16 µg/ml, trong đó hàm lượng lysozyme ở nghiệm thức 1 và 2 thấp hơn nghiệm thức 3, 4 và khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Hình 4.9). Theo Jeney et al. (2002) khi bổ sung 100 mg và 1.000 mg vitamin C vào thức ăn cho cá tầm lai sau 20 tuần thì có sự gia tăng đáng kể hàm lượng lysozyme và khác biệt ý nghĩa so với nhóm đối chứng và nhóm chỉ bổ sung 10 mg vitamin C. Tuy nhiên nghiên cứu của Doan Nhat Phuong (2007) lại cho rằng đối với cá trê lai khi bổ sung 70,9 mg Vitamin C vào khẩu phần thức ăn sau 10 tuần sẽ làm gia tăng hàm lượng lysozyme so với nhóm chỉ bổ sung 33,3 mg vitamin C và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Ngoài ra qua nghiên cứu của Ardó et al. (2008) cho rằng có sự gia tăng hàm lượng lysozyme ở tuần đầu đối với cá rô phi cho ăn thức ăn có trôn hoàng kỳ kết hợp với kim ngân hoặc hoàng kỳ kết hợp với Bo và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chỉ cho ăn với một loại thảo dược. Qua đó cho thấy rằng sự biến đổi về hàm lượng lysozyme của các nhóm cá ở các nghiệm thức khác nhau thì khác nhau.
Hình 4.9 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau 5 tuần cho ăn Hoàng kỳ. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3).
4.3.2 Hàm lượng lysozyme sau cảm nhiễm
Sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri thì hàm lượng lysozyme ở các nghiệm thức đều giảm so với trước cảm nhiễm, nghiệm thức 3 có hàm lượng lysozyme cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 5. Nghiệm thức 2 và 4 thì thấp hơn NT5 nhưng không khác biệt (p>0,05) (Hình 4.10). Tuy nhiên theo nghiên cứu của Choi et al. (2000) lại cho rằng khi tiêm sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn Mycobacterium spp trên cá hồi thì nồng độ lysozyme trong huyết thanh tăng cao ở tuần thứ 2 nhưng sang tuần thứ 8 thì giảm xuống. Theo Caruso et al. (2002) khi gây cảm nhiễm với E. tarda thì hàm lượng lysozyme của cá đều tăng lên sau ngày thứ 3 và 6. Bên cạnh đó, đối với cá trê lai khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila thì hàm lượng lysozyme của cá tăng lên so với trước khi gây cảm nhiễm (Doan Nhat Phuong 2007). Gần đây nhất là nghiên cứu của Harikrishman et al. (2010) khi trộn hỗn hợp gồm cây neem (Azadirach indica), cây é tía (Osimum sanctum) và cây nghệ (curcuma longa) với liều lượng 100, 200 và 400 mg/kg hỗn
hợp trên cho cá vàng ăn. Sau đó gây cảm nhiễm với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
thì hàm lượng lysozyme gia tăng đáng kể ở tuần thứ 2 và thứ 4.
Hình 4.10 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin)
So với kết quả nghiên cứu trên cho thấy sau khi gây cảm nhiễm thì hàm lượng lysozyme có giảm (0,96 %) nhưng giảm rất ít và khác biệt không ý nghĩa (P>0,05). Theo kết quả nghiên cứu của Sahoo et al (2007) khi gây cảm nhiễm cho cá chép Ấn Độ với vi khuẩn E.tarda thì hàm lượng lysozyme trong huyết thanh của cá giảm hơn so với trước cảm nhiễm. Từ đó cho thấy chủng vi khuẩn khác nhau, hàm lượng vi khuẩn khác nhau thì sự biến đổi về hàm lượng lysozyme cũng khác nhau. Nhìn chung hàm lượng lysozyme trong huyết thanh có thể tăng lên hay giảm xuống còn phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể cá, yếu tố stress, ở tùng thời điểm khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau (Stosik et al., 2001).
4.4 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh
Khả năng diệt khuẩn huyết thanh trước và sau cảm nhiễm sẽ được đánh giá thông qua chất chỉ thị màu MTT và cách bố trí các mẫu vào đĩa 96 giếng được trình bày trong phụ lục C. Kết quả tính toán phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh được trình bày qua đồ thị ở hình 4.11.
Hình 4.11 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá trước cảm nhiễm. (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). NT1 (Cho ăn thức ăn bình thường, không tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin)
Qua đồ thị cho thấy phần trăm vi khuẩn còn sống ở các nghiệm thức trước cảm nhiễm dao động từ 72,9 ±29,5 đến 102,5 ± 92,5 và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Thông qua phần trăm vi khuẩn còn sống sau khi tiếp xúc với huyết thanh cho thấy khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở nghiệm thức 4 là cao nhất 27,1 % vi khuẩn chết, so với nghiệm thức 1 thì 100% vi khuẩn còn sống. Tuy nhiên không có sự khác biệt giữa nghiệm thức 1 và 4 (p>0,05). Từ đó cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào thức ăn làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu thông qua việc làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu (Yin et al., 2006; Ardó et al., 2008; Jeney et al., 2008).
Hình 4.12 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá sau cảm nhiễm. NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin). (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Đối với cá được gây cảm nhiễm với vi khuẩn E .ictaluri thì phần trăm trung bình vi khuẩn còn sống sau khi tương tác với huyết thanh tương đối thấp. Nghiệm thức 2,3,4 chỉ có 22-26% vi khuẩn còn sống, tuy nhiên ở nghiệm thức 5 trên 100% vi khuẩn còn sống và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Thông qua phần trăm sống sót của vi khuẩn sau khi tiếp xúc với huyết thanh cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá cho ăn hoàng kỳ cao hơn cá không bổ sung hoàng kỳ. Đối với cá được tiêm vắc-xin thì khả năng diệt khuẩn cũng cao hơn nghiệm thức không bổ sung vắc-xin. Tuy nhiên giữa hai nhóm cá bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc- xin thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Theo nghiên cứu của Doan Nhat Phuong (2007) cho rằng khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá trê lai có tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila cao hơn so với huyết thanh của cá trê ở nghiệm thức không tiêm vi khuẩn, tương tự với kết quả của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2010) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri cho cá tra. Tuy nhiên cũng có những trường hợp vi khuẩn phát triển hơn 100% sau khi tiếp xúc với huyết thanh, nguyên nhân có thể do mẫu huyết thanh đã mất hoạt tính do phải trữ lâu trong tủ âm và cũng có thể do cá bị nhiễm nặng nên không còn khả năng miễn dịch.
So sánh với kết quả của đề tài cho thấy ở nghiệm thức 5 (nghiệm thức đối chứng dương) vi khuẩn phát triển quá mức sau khi tương tác với huyết thanh có thể do môi trường nuôi vi khuẩn giàu dinh dưỡng (NB) và nhiệt độ ủ thích hợp (28,50C) trong quá trình phân tích đã tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển tốt. Bên cạnh đó có thể do độc lực của vi khuẩn mạnh nên vẫn có khả năng phát triển được trong môi trường huyết thanh của cá.
Ngoài ra qua kết quả nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) cho thấy khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá tra bệnh cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ cao hơn cá bệnh nhưng không bổ sung hoàng kỳ. Từ đó cho thấy hoàng kỳ có thể làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở cá tra.
Như vậy, khả năng diệt khuẩn của huyết thanh ở cá bệnh có ăn hoàng kỳ và cá bệnh có tiêm vắc-xin kết hợp cho ăn hoàng kỳ cao hơn cá bệnh không ăn hoàng kỳ và không tiêm vắc-xin. Điều này cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ cho cá tra làm tăng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu trong việc đề kháng với vi khuẩn
E. ictaluri được thể hiện qua khả năng diệt khuẩn của huyết thanh.
4.5 Ảnh hưởng của chiết xuất hoàng kỳ lên sự nhiễm bệnh mủ gan do vi khuẩn
E. ictaluri
Kết quả thí nghiệm xác định nồng độ vi khuẩn gây chết 50% (LD50) cá thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.5). Từ kết quả trên ta xác định được mật độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm là 5,4x104.
Bảng 4.5 LD50 của vi khuẩn E. ictaluri thí nghiệm
Mật độ vi khuẩn
(CFU/ml) | |||
1 | Đối chứng | 0 | |
2 | 103 | 37 | |
3 | 104 | 45 | 5,4x104 |
4 | 105 | 95 | |
5 | 106 | 100 | |
Có thể bạn quan tâm!
-
Thành Phần Hóa Học Và Tác Dụng Dược Lý Cây Hoàng Kỳ -
Thí Nghiệm Gây Cảm Nhiễm Sau Khi Cho Ăn Thảo Dược 5 Tuần. -
Ảnh Hưởng Của Chất Chiết Xuất Từ Cây Hoàng Kỳ Lên Các Chỉ Tiêu Huyết Học Của Cá Tra Cảm Nhiễm Vi Khuẩn E. Ictaluri. -
Sử dụng chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasinodon hypophthalmus). - 7 -
Sử dụng chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasinodon hypophthalmus). - 8
Xem toàn bộ 72 trang tài liệu này.
Nghiệm thức % cá chết LD50
Sau 5 tuần cho ăn hoàng kỳ cá được gây cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri. Dấu hiệu sau 3 ngày cảm nhiễm cá có biểu hiện nổi đầu, bơi lờ đờ và chết. Biểu hiện bên ngoài thấy da nhạt màu, hậu môn sưng đỏ, mắt lồi, một số cá bị xuất huyết ở da và vây. Giải phẩu bên trong nội tạng có dịch trong xoang, trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng (Hình 4.13). Một số cá nhiễm nặng có hiện tượng thận sưng to và bị nhũng. Dấu hiệu bệnh lý của cá tra trong thí nghiệm này sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri giống như mô tả của Từ Thanh Dung và ctv. (2004) và Đặng Thụy Mai Thy (2010).
Hình 4.13 Cá tra thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. (mũi tên chỉ đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng)
Qua biểu đồ ở hình 4.14 cho thấy tỷ lệ cá chết tích lũy cao nhất ở NT5 đạt 53%, kế đến ở NT2 là 36%, NT3 là 33% và thấp nhất là NT4 24%. Thời gian cá bắt đầu chết sau khi tiêm vi khuẩn ở các nghiệm thức thì khác nhau, trong đó NT5 cá bắt đầu chết từ ngày 3 đến ngày 11, NT4 và NT3 cá bắt đầu chết từ ngày 4 đến ngày 9, NT2 cá bắt đầu chết từ ngày 4 đến ngày 10. Cá chết liên tục trong vòng 7 ngày và sau đó không chết đến khi kết thúc thí nghiệm. Cá ở NT1 không chết chứng tỏ cá thí nghiệm là cá khỏe. Dựa vào kết quả của biểu đồ trên cho thấy tỷ lệ sống sau 15 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri giữa các nghiệm thức có khác nhau, NT4 có tỷ lệ sống cao nhất là 76%. Tỷ lệ sống thấp nhất ở NT5 là 47%. Ở NT2 và NT3 có tỷ lệ sống tương đương nhau lần lượt là 64% và 67%. Tỷ lệ sống giữa NT2 và NT3 là không khác biệt về mặt thống kê (p>0,05). Tuy nhiên sự khác biệt về tỷ lệ sống giữa NT4 so với NT2 và NT3 là có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Điều này chứng tỏ rằng thức ăn có bổ sung 0,5% hoàng kỳ kết hợp tiêm vắc-xin giúp cá đề kháng lại sự cảm nhiễm bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra tốt hơn là chỉ cho ăn hoàng kỳ hoặc chỉ tiêm vắc-xin. Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu trên cá tra, sau khi gây
cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri, cá được cho ăn thức ăn có bổ sung 0,2% Nutribull có khả năng giúp cá đề kháng lại bệnh do vi khuẩn này gây ra nhờ thành phần beta glucan và nucleotide có trong sản phẩm từ đó nâng cao tỷ lệ sống của cá (Lê Thị Nga và ctv., 2009). Ngoài ra qua nghiên cứu của Yin et al. (2008) khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn 2 loại thảo dược, gây cảm nhiễm với vi khuẩn A. hydrophila có tỷ lệ sống cao. Tỷ lệ sống cao nhất (60%) là nhóm cá có tiêm vắc-xin và được cho ăn bằng cả 2 loại thảo dược, trong khi đó hầu như 90% cá đối chứng (kiểm soát âm tính) và 60% cá chỉ được tiêm vắc-xin (kiểm soát dương tính) đã chết.
Hình 4.14 Tỷ lệ chết cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri. NT1 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ, không tiêm vắc-xin, không tiêm vi khuẩn), NT2 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, tiêm vi khuẩn). NT3 (Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần 3, tiêm vi khuẩn). NT4 (Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, tiêm vi khuẩn). NT5 (Cho ăn thức ăn bình thường, tiêm vi khuẩn, không tiêm vắc-xin).