Mẫu XS71 có trạng thái vô tính, ký sinh trên bộ Lepidoptera (Hình 3.22), thu được tại VQG Xuân Sơn - Phú Thọ ở tọa độ 21o6166‟N - 104o56,284‟E, độ cao 650m, nơi có mật độ che phủ của rừng lớn.
Bó sợi mọc thẳng, màu vàng nhạt, có kích thước 1-2cm, bào tử phân bố dọc theo bó sợi có màu trắng giống hạt đậu (Hình 3.22a). Bào tử không có màng bao bọc, kích thước từ 5-7µm (Hình 3.22b). Mẫu nấm khi nuôi cấy trên môi trường Sabouraud có hệ sợi màu trắng, mịn. Nuôi cấy trên lam kính quan sát bào tử đính có dạng chuỗi, trên các chuỗi có các bào tử hình hạt đậu kích thước 4,5-5 µm (Hình 3.22d, 3.22e). Đặc điểm của mẫu XS71 nghiên cứu là đặc điểm của chi Isaria.
Hình 3.22. Hình thái mẫu XS71
a) Trạng thái ngoài tự nhiên; b) Bào tử; c) Hệ sợi trên môi trường Sabouraud;
d) Cuống sinh bào tử (Scale bar: a- 0,5cm, b - 5µm, c-1cm, d-10µm)
Mẫu XS77 có trạng thái vô tính, ký sinh trên bộ Coleoptera (Hình 3.23), thu được tại VQG Xuân Sơn - Phú Thọ ở tọa độ 21o6165‟N - 104o56,294‟E, độ cao 450m, nơi có mật độ che phủ của rừng lớn.
Bó sợi mọc thẳng xuất phát từ khe cổ của ký chủ, màu vàng - nâu, được chia thành 2 phần, có kích thước 0.2cm x 8cm, phần chứa bào tử bắt đầu từ ½ của bó sợi về phía đỉnh (Hình 3.23a). Các bào tử dạng bột, hình tròn, màu nâu, kích thước 2-2,81µm (Hình 3.23b, 3.23c). Khi nuôi cấy trên môi trường Sabouraud, hệ sợi nấm mỏng, mịn (Hình 3.23d). Đặc điểm hình thái của mẫu XS77 nghiên cứu rất giống với đặc điểm của chi aPurpureocillium.
Hình 3.23. Hình thái mẫu XS77
a-b) Trạng thái ngoài tự nhiên; c) Bào tử; d) Hệ sợi trên môi trường Sabouraud (Scale bar: a-2cm, b-1000µm, c-5µm, d-1cm)
Mẫu XS83 có trạng thái vô tính, ký sinh trên bộ Lepidoptera (Hình 3.24), thu được tại VQG Xuân Sơn - Phú Thọ ở tọa độ 21o6165‟N - 104o56,294‟E, độ cao 550m.
Hình 3.24. Hình thái mẫu XS83
a) Trạng thái ngoài tự nhiên; b) Bào tử; c) Hệ sợi trên môi trường Sabouraud; d) Cuống sinh bào tử (Scale bar: a- 1cm, c-1cm, d-10µm)
Sợi nấm ngắn, rời rạc mang các bào tử dạng bột trắng bao phủ bề mặt ký chủ (Hình 3.24a). Các bào tử hình dạng hình trứng, có kích thước nhỏ 2-3µm (Hình 3.24b). Khi nuôi cấy trên môi trường Sabouraud hệ sợi có màu trắng sau đó chuyển dần sang vàng (Hình 3.24c). Bào tử nuôi cấy trên lam kính có dạng chuỗi dài kích thước 2-3µm (Hình 3.24d). Đặc điểm mẫu XS83 là đặc điểm của chi Beauveria.
3.1.1.2. Định loại phân tử các chủng nấm ký sinh côn trùng đ phân lập ở khu vực nghiên cứu
Họ Cordycipitaceae và họ Ophiocordycipitaceae là họ có số lượng loài tương đối đa dạng trong ngành Nấm túi (Ascomycota). Vì thế mối quan hệ di truyền của các loài, các chi trong hai họ cũng rất phức tạp. Trong 24 mẫu đã phân lập, dựa vào đặc điểm hình thái và kết quả tách chiết ADN, chúng tôi tiến hành giải trình tự ADN của 10 chủng đại diện. Trình tự ADN vùng ITS của các chủng được thể hiện ở trong Phụ lục 9. Dựa vào phân tích trình tự
vùng ITS, mối quan hệ di truyền của các chủng trong các chi nghiên cứu đã được xác định. Kết quả được thể hiện ở hình 3.25.
Kết quả trên cho thấy 04 chủng CPA13V, CPA5, XS37, XS38 được xếp vào cùng một nhóm, và có quan hệ gần gũi với các chủng Cordyceps bassiana BCC9082 (trình tự gen EF411234.1), C. bassiana BCMUBB01 (trình tự gen AB079609), Beauveria bassiana BCC2655 (trình tự gen MN401668), B. bassiana 64218 (trình tự gen 401664) với tỷ lệ bootstrap 92%. Xét về đặc điểm hình thái, các chủng CPA5, XS37, XS38 có đặc điểm hình thái tương đồng và giống loài B. bassiana. Riêng đặc điểm ngoài tự nhiên của chủng CPA13V là trạng thái hữu tính của loài C. bassiana. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với định loại hình thái.
Tương tự đối với các chủng CPA31, CPA14V, XS67 khi định loại hình thái được phân loại vào chi Cordyceps, CPA40 được phân loại vào chi Isaria. Kết quả cây phát sinh loài ở trên, CPA31 có quan hệ gần gũi với các chủng C. amoenerosea CBS738.73 (trình tự gen MH860795), Isaria amoenerosea ARSEF744 (trình tự gen EU553281). Chủng CPA14V, XS67, CPA40 lần lượt có quan hệ gần gũi với chủng C. cateniannulata TBRC (trình tự gen MF140753.1), C. takaomontana BCC12688 (trình tự gen EU807996) và I. tenuipes ARSEF (trình tự gen HQ880827.1).
Kết quả nghiên cứu phát sinh chủng loại cũng cho thấy tất cả 08 chủng đại diện 03 chi Cordyceps, Beauveria, Isaria của họ Cordycipitaceae đều nằm trong một nhánh của cây phát sinh (Hình 3.25). Tuy nhiên, có thể nhận thấy không có sự chia nhóm rõ ràng giữa ba chi này trên cây phân loại. Nhiều loài trong các chi Beauveria và Isaria là trạng thái vô tính của Cordyceps nên khi định loại phân tử các chủng thuộc ba chi này sẽ rất khó khăn. Chính vì vậy sẽ rất khó khăn khi nghiên cứu định loại các chủng thuộc 03 chi Cordyceps, Beauveria, Isaria mà chỉ dựa trên trình tự ADN vùng ITS. Cần phải kết hợp với đặc điểm hình thái và các kết quả định loại sinh học phân tử dựa trên các DNA barcoding khác giúp tăng độ chính xác trong phân loại đến loài.
Hình 3.25. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu
Tiếp đến đối với các chủng XS77 và CPA1 đại diện của 02 chi thuộc họ Ophiocordycipitaceae, XS77 có quan hệ gần gũi với các chủng Purpureocillium lilacinum SF959 (trình tự gen MT530235.1), P. lilacinum NBRC31914 (trình tự gen LC008209.1) với tỷ lệ bootstrap lên đến 99%. Chủng CPA1 có quan hệ gần gũi với các chủng Ophiocordyceps myrmecophila BCC82984 (trình tự gen MH028148.1) và O. myrmecophila BCC82262 (trình tự gen MH028146.1) với tỷ lệ bootstrap 99%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định loại hình thái. Kết quả cây phát sinh chủng loại trên cũng cho thấy, 02 chủng đại diện 02 chi thuộc họ Ophiocordycipitaceae không nằm cùng một nhánh với 08 chủng đại diện 03 chi thuộc họ Cordycipitaceae. Trong các khoá phân loại trước kia, cả 05 chi nấm Ophiocordyceps, Purpureocillium, Cordyceps, Beauveria và Isaria đều được xếp chung vào một họ Clavicipitaceae. Đến năm 2007 dựa trên sự khác biệt về mặt di truyền khi nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa 91 taxon của các chi nấm ký sinh côn trùng thuộc họ Clavicipitaceae, Sung và cs đã chia họ Clavicipitaceae ra thành 03 họ bao gồm Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae [166]. Kết quả phát sinh chủng loại của 10 chủng nấm đại diện trên cũng phản ánh phần nào sự khác biệt di truyền của các chi của hai họ Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae, khẳng định sự phân chia 03 họ trên của Sung và cs là hoàn toàn hợp lý [85].
Như vậy, dựa trên đặc điểm hình thái mẫu vô tính, hữu tính ngoài tự nhiên; đặc điểm nuôi cấy và trình tự ITS, 24 chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập được phân loại vào 06 chi nấm bao gồm chi Aschersonia (01 mẫu), Purpureocillium (01 mẫu), Beauveria (08 mẫu), Cordyceps (06 mẫu), Isaria (05 mẫu), và Ophiocordyceps (03 mẫu). Kết quả được dẫn ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập được
Chi | Số mẫu | Chủng | Ký chủ | |
Clavicipitaceae | Aschersonia | 01 | XS01 | Hemiptera |
Cordycipitaceae | Beauveria | 08 | CPA5 | Coleoptera |
CPA15 | Coleoptera | |||
CPA16 | Lepidoptera | |||
CPA44 | Coleoptera | |||
XS36 | Coleoptera | |||
XS37 | Coleoptera | |||
XS38 | Hymenoptera | |||
XS83 | Lepidoptera | |||
Cordyceps | 06 | CPA3 | Coleoptera | |
CPA13V | Lepidoptera | |||
CPA14V | Blattodea | |||
CPA31 | Lepidoptera | |||
XS57 | Hymenoptera | |||
XS67 | Hymenoptera | |||
Isaria | 05 | CPA40 | Blattodea | |
XS07 | Lepidoptera | |||
XS66 | Hymenoptera | |||
XS69 | Lepidoptera | |||
XS71 | Lepidoptera | |||
Ophiocordycipitaceae | Ophiocordyceps | 03 | CPA1 | Hymenoptera |
XS12 | Hymenoptera | |||
XS65 | Hymenoptera | |||
Purpureocillium | 01 | XS77 | Coleoptera |
Có thể bạn quan tâm!
-
Phương Pháp Định Lượng Cod Có Trong Sinh Khối Nấm -
Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn - 10 -
Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn - 11 -
Khả Năng Sinh Tổng Hợp Cyclooligomer Depsipeptide Của Các Chủng Nấm Ký Sinh Côn Trùng Đã Phân Lập -
Kết Quả Xây Dựng Cây Phát Sinh Loài Dựa Trên Vùng Gen Its1-5.8S Rdna-Its2 -
Ảnh Hưởng Của Độ Ph Môi Trường Đến Sự Sinh Trưởng Và Khả Năng Sinh Tổng Hợp Cyclooligomer Depsipeptide Của Chủng C. Cateniannulata Cpa14V
Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.
(Ghi chú: Hemiptera - Bộ Cánh nửa; Coleoptera - Bộ Cánh cứng; Lepidoptera
- Bộ Cánh vảy; Hymenoptera - Bộ Cánh màng; Blattodea - Bộ gián)
3.1.2. Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn
Ở nấm, trình tự ITS thường được sử dụng phổ biến để trong định loại. Tuy nhiên, rất khó xác định đến mức độ loài nếu chỉ căn cứ vào trình tự ITS [152]. Bởi thế, trong nghiên cứu này tác giả định loại các chủng đã phân lập bằng cách kết hợp giữa đặc điểm hình thái và trình tự đoạn ITS. Kết quả 33,3% các chủng thuộc chi Beauveria, tiếp theo là chi Cordyceps (25%) và Isaria (20,8%). Kết quả này tương tự như kết quả của Aung và cs năm 2008. Khi định loại 34 chủng nấm, Aung và cs đã tìm thấy 15 loài phổ biến phân bố ở rừng Chiang Mai (Thái Lan), trong đó chi Beauveria và Isaria có tần suất xuất hiện cao nhất [21]. Hiện có 6/55 loài nấm thuộc chi Aschersonia (A. aleyrodis, A. badia, A. basicystis, A. brunnea, A. cubensis, A. goldiana, A. suzukii) được ghi nhận ký sinh trên bộ Hemiptera ở Đài Loan [178]. Sự xuất hiện loài thuộc chi Aschersonia ký sinh trên Hemiptera là lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam [36].
Trong 5 bộ ký chủ, Hymenoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập được và là ký chủ của nhiều chi nấm nhất trong nghiên cứu bao gồm Ophiocordyceps, Cordyceps, Beauveria, và Isaria. Tương tự bộ ký chủ Coleoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập được và là ký chủ của 3/6 chi nấm trong nghiên cứu (Beauveria, Cordyceps và Purpureocillium). Beauveria là một chi phổ biến được tìm thấy trên bộ côn trùng này và một số loài thuộc chi Beauveria đã được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp [157]. Tuy nhiên, chỉ có 4/5 loài B. amorpha, B. bassiana, B. caledonica, và B. tenella đã được ghi nhận ký sinh trên Coleoptera [36]. Các ký chủ khác của loài nấm thuộc chi Beauveria là Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Lepidoptera, và Orthoptera. Beauveria trong nghiên cứu này phong phú hơn nhiều so với các nghiên cứu trước đó ở Campuchia [87] và tương tự với các nghiên cứu ở Thái Lan [21].