Ảnh Hưởng Của Độ Ph Môi Trường Đến Sự Sinh Trưởng Và Khả Năng Sinh Tổng

sinh trưởng của Cordyceps militaris, một trong những loài nấm được nghiên cứu nhiều, đạt 16,7±1,3 g/l [192].

Chủng C. cateniannulata CPA14V có khả năng sinh tổng hợp COD ở tất cả 05 loại môi trường được sử dụng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, COD được hình thành và tích lũy nhiều nhất trong tế bào khi nuôi cấy trong môi trường Czapek-Dox vào ngày thứ 6 của quá trình nuôi cấy, đạt 6,45 mg/g và duy trì nồng độ cao trong hai ngày tiếp theo, đạt lần lượt là 5,537±0,307 mg/g và 5,334±0,210 mg/g. Hàm lượng COD giảm nhanh chóng ở ngày thứ 9, chỉ đạt 1,666±0,801 mg/g (chỉ bằng 25,8% so với hàm lượng COD ở ngày thứ 6). Trong môi trường Sabouraud, hàm lượng COD tích lũy trong tế bào đạt giá trị cao nhất (0,809±0,265 mg/g) ở ngày thứ 6, thứ 7. Khả năng sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V tương đối thấp khi được nuôi cấy trong môi trường PGB, môi trường MM và môi trường FDM. Sau 24 giờ nuôi cấy, mặc dù sinh khối chưa nhiều nhưng ở các môi trường PGB, Sabouraud và FDM đã có sự hình thành và tích lũy COD. COD được phát hiện ở môi trường MM sau 48 giờ và trong môi trường CzD sau 72 giờ nuôi cấy. Ở cả 05 loại môi trường nuôi cấy, lượng COD cao nhất được xác định ở thời điểm 01 ngày trước khi sinh khối đạt cực đại và duy trì nồng độ cao trong 2-3 ngày, sau đó giảm đột ngột về giá trị thấp, mặc dù sinh khối khá ổn định hoặc giảm chậm trong các ngày tiếp theo. Kết quả nghiên cứu này rất có ý nghĩa cho các nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu cho chủng sinh tổng hợp COD cũng như nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch sản phẩm.

Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái của trạng thái vô tính ngoài tự nhiên và đặc điểm nuôi cấy cho thấy chủng phân lập được thuộc chi Cordyceps, một trong những chi nấm có nhiều loài có giá trị quý. Trong nghiên cứu này, chủng C. cateniannulata CPA14V sinh trưởng tốt trong môi trường Sabouraud và tích lũy COD cao khi nuôi cấy trong môi trường

Czapek-Dox. Đây là những kết quả có ý nghĩa cho công nghệ. Khả năng sinh tổng hợp COD của chủng CPA14V đạt 6,452±0,406 mg/g, tương ứng với trên 64 mg/l là tốt và cao hơn kết quả nghiên cứu đã được công bố trước đây (khi tính toán hiệu suất trên 1 lít môi trường) của chủng Fusarium sambucinum ITEM-846 đạt 0,23 mg/g [100], chủng Cordyceps takaomontana BCC1409 đạt 16,2 mg/l; chủng Isaria tenuipes BCC1382 đạt 32,2 mg/l [103]. Vì thế chúng tôi lựa chọn môi trường Czapek - Dox làm môi trường cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4.2. Ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng C. cateniannulata CPA14V

Độ pH môi trường ảnh hưởng đến sự phân ly của các ion, cấu trúc và hoạt động của các enzyme nên nó có ý nghĩa quyết định đến quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp COD. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến chủng tuyển chọn nhằm tìm ra khoảng pH tối ưu cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả được thể hiện ở hình 3.32.

Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.

Chủng nấm nghiên cứu hầu như không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất chậm ở giá trị pH môi trường thấp hơn 6 (Hình 3.32). Chủng nghiên cứu có thể sinh trưởng rất tốt khi giá trị pH dao động từ 6,5 đến 8 mà không có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, sự sinh tổng hợp COD cao nhất ở pH 8 và khác biệt đáng kể so với các vùng còn lại. Tổng sản lượng COD ở pH 8 là 50,774 ± 1,046 mg/l, tiếp theo là 46,587 ± 0,429 mg/l ở pH 7.5 (Xem hình 3.32). Năng suất giảm dần khi ở giá trị pH thấp hơn.

Trong các nghiên cứu đã công bố, không có nhiều nghiên cứu đề cập đến ảnh hưởng của độ pH môi trường đối với sự sinh tổng hợp COD. Qua khảo sát, độ pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp COD ở nấm ký sinh côn trùng rất khác nhau giữa các chi khác nhau cũng như các loài trong cùng một chi. Cụ thể như theo Paszkiewicz và cs, độ pH môi trường nuôi cấy tối ưu cho chủng Conidiobolus coronatus sinh tổng hợp một số COD như beauvericin, enniatin A, B là 5 [133], nhưng trong một số nghiên cứu khác thì pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp COD là 7,2 [135, 194]. Hiện trong các công trình nghiên cứu đã công bố cũng không có thông tin về độ pH môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của loài C. cateniannulata. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cho thấy khả năng tạo COD tổng số của nấm là tối ưu trong điều kiện pH môi trường dao động trong dải pH từ 6,5-8. pH môi trường tối ưu của chủng nghiên cứu tương tự các chủng Fusarium redolens Dzf2 [203], Cordyceps militaris W-12 [214]…

3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V

Nguồn cacbon có vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp COD của các loài nấm ký sinh côn trùng. Nguồn cacbon không chỉ cung cấp nguyên liệu và năng lượng cấu trúc tế bào mà còn có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình trao đổi chất qua đó chi phối con đường sinh tổng hợp COD.

Hình 3.33. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V

Chúng tôi tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của một số nguồn cacbon thông thường đến sinh trưởng và mức độ sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V. Kết quả cho thấy chủng C. cateniannulata CPA14V có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường CzD với nguồn cacbon khác nhau (Hình 3.33).

Trong các nguồn cacbon nghiên cứu, glucose thể hiện là nguồn cacbon phù hợp chất cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD với khối lượng tế bào khô là 10,2 g/l, hàm lượng COD đạt 5,797 mg/g. Tiếp theo là nguồn fructose và sucrose với hàm lượng tế bào khô và hàm lượng COD lần lượt là 9,395 g/l; 6,003 mg/g và 8,359 g/l; 5,630 mg/g (Phụ lục 4). Trên nguồn glucose và fructose, mặc dù hàm lượng COD tích lũy được có giảm so với môi trường CzD sơ sở nhưng hàm lượng tế bào khô tăng cao vì thế tổng năng suất COD của chủng nghiên cứu tăng lên đáng kể lần lượt đạt 59,155 mg/l và 56,4 mg/l. COD được tích lũy ở nồng độ cao nhất khi được nuôi cấy trên CzD với lactose làm nguồn cacbon. Tuy nhiên, tổng năng suất sản xuất COD thấp do

chủng nấm nghiên cứu sinh trưởng chậm trên môi trường này. Tương tự đối với môi trường nuôi cấy sử dụng các nguồn tinh bột tan, galactose, mannitol, lượng COD thu được chỉ đạt dưới 40 mg/l môi trường nuôi cấy. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã công bố cho thấy khả năng tạo COD tổng số của nấm là tối ưu trong môi trường chứa glucose [91], [203]. Kết quả này cho thấy vai trò quan trọng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp COD của chủng nghiên cứu. Đồng thời chứng minh sự liên quan giữa quá trình sinh tổng hợp COD và con đường trao đổi chất của nấm cũng như sự cần thiết của các loại đường hexose hoặc pentose trong con đường sinh tổng hợp COD cụ thể là beauvericin do Wang và cs đề xuất [194].

Tóm lại, chủng nấm C.cateniannulata CPA14 sinh trưởng và sinh tổng hợp COD rất tốt khi được nuôi cấy trong môi trường có chứa nguồn cacbon là glucose. Vì vậy chúng tôi lựa chọn glucose là nguồn cacbon cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn.

3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V Bên cạnh nguồn cacbon, nguồn nitơ là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến

sự sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và của nấm ký sinh côn trùng nói riêng. Đặc biệt trong con đường sinh tổng hợp một số COD từ nấm ký sinh côn trùng như beauvericin, enniatin…, nguồn nitơ cung cấp nitơ cho prephenate hoặc valine chuyển hóa thành L-phenylalanine (L-Phe) hoặc acid D-hydroxyisovaleric acid (D-HYIV). Đây là hai hoạt chất “chìa khóa” trong quá trình sinh tổng hợp các COD này [194]. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của một số nguồn nitơ thông thường đến sinh trưởng và mức độ sinh tổng hợp COD của chủng C.cateniannulata CPA14V.

Hình 3.34. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V

Tương tự như nguồn cacbon, C.cateniannulata CPA14 có thể sinh trưởng tốt trong môi trường CzD với các nguồn nitơ khác nhau (Hình 3.34). Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đối với sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng nghiên cứu cho thấy nguồn nitơ hữu cơ có tác động tốt hơn hẳn so với các nguồn nitơ vô cơ. Cao thịt, cao nấm men, pepton, NaNO3 và KNO3 là rất phù hợp với sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng nghiên cứu. Lượng COD tích lũy lần lượt là 60,330 ± 1,280 g/l, 65,789 ± 2,186 g/l, 60,771 ± 1,844 g/l, 55,961 ± 2,598 g/l và 53,902 ± 0,619

g/l (Xem hình 3.35). Có thể thấy nguồn nitơ tốt nhất cho sinh tổng hợp COD của chủng CPA14V là cao nấm men. Khả năng này tương đối cao khi so sánh với các chủng nấm khác thuộc các chi Isaria [103], Fusarium [100] và Conidiobolus [133]. Chủng C.cateniannulata CPA14V sinh trưởng và tích lũy COD kém hơn trong môi trường nuôi cấy có sử dụng nguồn nitơ là NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3. Lượng COD sinh tổng hợp được lần lượt đạt 21,393 mg/l, 36,717 mg/l và 37,793 mg/l. Như vậy, sự sinh trưởng và khả năng sinh

tổng hợp COD của chủng C.cateniannulata CPA14V tốt nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có chứa nguồn nitơ hữu cơ là cao nấm men hoặc nguồn nitơ vô cơ là NaNO3. Kết quả này tương tự các nghiên cứu đã công bố của các nhóm tác giả Xu và cs [203], Lee và cs [91]… Tuy nhiên, cao nấm men là nguồn cơ chất đắt tiền, nên có thể thấy NaNO3 là nguồn nitơ tiềm năng giúp giảm chi phí trong quá trình sản xuất COD ở các quy mô lớn hơn.

3.5. Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V

3.5.1. Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V ở quy mô phòng thí nghiệm

3.5.1.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ C. cateniannulata CPA14V

- Kết quả chuẩn bị sinh khối mẫu

Trong các nghiên cứu về thu hồi, tinh sạch COD đã công bố, đa phần sinh khối (hệ sợi nấm hoặc thể quả) được chuẩn bị là sinh khối nấm tươi hoặc đã được sấy khô ở nhiệt độ cao [139, 168]. Tuy nhiên, đối với sinh khối nấm thu được bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng thì việc thu rửa và đông khô sinh khối sẽ đem lại những lợi ích nhất định. Cụ thể như rửa được một phần dịch nuôi cấy, điều này tạo thuận lợi cho các bước tiếp theo trong quá trình thu hồi, tinh sạch COD. Tiếp theo, việc đông khô không sử dụng nhiệt độ cao để sấy sinh khối nấm cũng có thể hạn chế ảnh hưởng của nhiệt độ các đến các hoạt chất trong hệ sợi nấm. Tổng khối lượng sinh khối nấm đông khô đã chuẩn bị phục vụ cho quá trình tách chiết của chúng tôi là 98,8g.

- Kết quả ngâm chiết và tạo cặn chiết

Trong thu hồi và tinh sạch các hợp chất tự nhiên nói chúng và COD nói riêng, việc lựa chọn dung môi ngâm chiết, tạo cặn chiết đóng vai trò rất quan

trọng. Việc lựa chọn được dung môi có độ phân cực phù hợp, vừa có thể hòa tan được các hợp chất COD trong sinh khối nấm vừa thuận lợi cho việc tinh sạch ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi, tinh sạch. Trong các nghiên cứu đã công bố, các tác giả sử dụng rất đa dạng các dung môi khác nhau từ kém phân cực đến phân cực mạnh để ngâm chiết và tạo cặn chiết. Tiêu biểu như là methanol, ethanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, acetonitril... [62, 83, 113, 133, 168, 187, 201].

Trong thí nghiệm khảo sát phần thực nghiệm, chúng tôi sử dụng ethanol để ngâm chiết thu cao chiết tổng. Kết quả thu được từ 25g sinh khối nấm thu được 16,5g cao chiết tổng CCM. Sau đó tiếp tục chiết lần lượt sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate. Kết quả thu được: 3,1g cao chiết n-hexane (CCH); 4,2g cao chiết dichloromethane (CCD); 2,0g cao chiết ethyl acetate (CCE); 5,1g cặn tan trong nước (CCN). Để lựa chọn cao chiết phù hợp mục tiêu hướng tới đích thu được COD nhiều nhất kết hợp đích hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính sinh học của cao chiết tổng CCM và các cao chiết CCH, CCD, CCE, CCN. Dựa trên kết quả thử hoạt tính (xem mục 3.6) và tham khảo các nghiên cứu đã công bố, chúng tôi lựa chọn cao chiết dichloromethane (CCD) để tiến hành các bước tinh sạch bằng sắc ký cột tiếp theo (xem mục 2.2.3.3). Kết quả thí nghiệm khảo sát thu được chất sạch CC1. Nghiên cứu dữ liệu phổ NMR của CC1 là COD có hoạt tính sinh học.

Dựa trên kết quả của thí nghiệm khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn dichloromethane làm dung môi ngâm chiết thu cao tổng nhằm giảm hao hụt COD qua nhiều bước chiết kết hợp với kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận COD (xem mục 3.5.2), chúng tôi tiến hành ngâm chiết thu cao chiết tổng từ sinh khối nấm bằng dichloromethane. Các bước cụ thể xem mục 2.2.3.3. Kết quả thu được từ 25g sinh khối đông khô nấm C.