Các Mồi Issr Sử Dụng Trong Phân Tích Đa Dạng Di Truyền

3.3.2. Các mồi ISSR sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền

Đề tài sử dụng 19 mồi ISSR (bảng 3.2) để đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống hoa lay ơn thu thập được.

Bảng 3.2. Danh sách các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu

STT

Chỉ thị	Trình tự nucleotit	Nhiệt độ gắn mồi (oC)	Tài liệu tham khảo
1	ISSR 15	(AG)8G	58,3	Alam & cs., 2015
2	ISSR 46	(AG)8T	49	Arif & cs., 2009
3	ISSR 49	(GA)8T	49	Arif & cs., 2009
4	ISSR 50	(TG)8AG	50	Liu & cs., 2013
5	ISSR 51	(GA)8A	52	Arif & cs., 2009
6	ISSR 52	(CT)8G	51	Arif & cs., 2009
7	ISSR 53	( CA)₈A	47	Arif & cs., 2009
8	ISSR 55	(AC)8T	51	Arif & cs., 2009
9	ISSR 56	(AC)8G	51	Arif & cs., 2009
10	ISSR 57	(AG)8TG	50	Liu & cs., 2013
11	ISSR 58	(AG)8GA	50	Liu & cs., 2013
12	ISSR 59	(GA)8CT	49	Arif & cs., 2009
13	ISSR 64	ACA(GT)7	51	Arif & cs., 2009
14	ISSR 69	(GGGTG)3	49	Arif & cs., 2009
15	ISSR 808	(AG)8C	55	Zhang & cs., 2016
16	ISSR 824	(TC)8G	55	Zhang & cs., 2016
17	ISSR 827	(AC)8G	55	Zhang & cs., 2016
18	ISSR 834	(AG)8YT	54	Zhang & cs., 2016
19	ISSR 880	(GGAGA)3	60	Zhang & cs., 2016

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1. Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ cho lai tạo giống hoa lay ơn mới

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống lay ơn nghiên cứu

- Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống lay ơn nghiên cứu bằng hình thái và chỉ thị phân tử

- Ước lượng các tham số di truyền và mối tương quan giữa các tính trạng đặc trưng của hoa lay ơn

- Khảo sát đặc điểm hình thái, sức sống và chất lượng hạt phấn hoa lay ơn

3.4.2. Tạo quần thể lai, đánh giá và chọn lọc các dòng lai mới tạo ra

- Tạo quần thể lai bằng phương pháp lai hữu tính

- Đánh giá cá thể trong quần thể lai

- Đánh giá chọn lọc các dòng lai hoa lay ơn triển vọng

- Thử nghiệm các dòng lai lay ơn triển vọng tại một số địa phương.

3.4.3. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật tăng hiệu quả nhân giống của dòng lai lay ơn mới tạo ra

- Tạo củ bi cho giống hoa lay ơn mới bằng phương pháp in vitro

- Tạo củ thương phẩm cho giống hoa lay ơn mới trên đồng ruộng.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ cho lai tạo giống hoa lay ơn mới

- Thời gian nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành ở vụ Đông Xuân 2015 -

2016

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh,

Gia Lâm, Hà Nội

- Bố trí thí nghiệm: Các mẫu giống lay ơn được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp lại, 300 cây/giống

- Phương pháp lấy mẫu và lượng mẫu theo dõi: chọn mẫu ngẫu nhiên (trừ các cá thể ở đường biên), 10 mẫu/ô thí nghiệm. Mỗi ô thí nghiệm có diện tích 5m2, mỗi ô trồng 100 cây.

3.5.1.1. Đánh giá các đặc điểm nông sinh học

- Chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển

+ Thời gian từ trồng đến nảy mầm/phân hóa mầm hoa/trỗ bông/thu hoạch (ngày): tính từ khi bắt đầu trồng đến khi 10%, 80% tổng số cây trồng đạt chỉ tiêu đó.

+ Chiều dài lá (cm): Tổng chiều dài lá/tổng số lá theo dõi. Đo từ gốc lá đến đỉnh lá của lá dài nhất của cây.

+ Số lá/cây (lá): Tổng số lá/tổng số cây theo dõi. Đếm toàn bộ số lá hoàn chỉnh từ gốc đến lá bao đòng.

+ Thế lá (cấp) đánh giá theo bảng mô tả của Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của hoa lay ơn - UPOV 2013: cấp 1 (lá thẳng), cấp 3 (lá xiên), cấp 5 (lá ngang) và cấp 7 (lá rủ)

+ Chiều rộng tán lá (cm): Tổng chiều rộng tán lá/ tổng số cây theo dõi. Đo phần rộng nhất của tán lá.

- Chỉ tiêu về ra hoa và chất lượng hoa

+ Chiều dài cành hoa (cm): Tổng chiều dài cành hoa/ tổng số cành hoa theo dõi. Đo từ gốc đến đỉnh cành hoa

+ Chiều dài đoạn mang hoa (cm): Tổng chiều dài đoạn mang hoa/ tổng số cành hoa theo dõi. Đo từ gốc của bông hoa đầu tiên đến đỉnh bông hoa cuối cùng.

+ Đường kính cành hoa (cm): Tổng đường kính/ tổng số cành hoa theo dõi. Đo bằng thước Palme ngay ở giữa đốt cổ bông

+ Số hoa/cành (hoa): Tổng số hoa/ tổng số cành hoa theo dõi. Đếm tất cả các hoa có trên cành hoa

+ Đường kính hoa (cm): Đo theo chiều ngang phần lớn nhất của mặt hoa của bông hoa thứ 2 từ gốc cành. Đo khi hoa đã nở hoàn toàn bằng thước Palme.

- Chỉ tiêu về năng suất hoa và củ giống

+ Tỷ lệ trỗ bông (%): số bông trỗ thoát/tổng số cây trồng x 100

+ Tỷ lệ cành hoa thu hoạch (%): số cành hoa thu hoạch/tổng số cây trồng x

100. Cành hoa thu hoạch là hoa không bị sâu bệnh, cành hoa thẳng, mập... có giá trị thương phẩm.

+ Cành hoa loại 1: Chiều dài cành >100 cm, số lượng hoa/cành >10 hoa, mức độ khô đầu lá <3% chiều dài lá

+ Cành hoa loại 2: Chiều dài cành <100 cm, số lượng hoa/cành 6 - 10 hoa, mức độ khô đầu lá <5% chiều dài lá

+ Số củ bi/củ (củ): Tổng số củ bi hình thành/ tổng số củ theo dõi.

- Chỉ tiêu theo dõi mức độ sâu hại: phân cấp theo Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng QCVN01- 38:2010/BNNPTNT

 Cấp 1: Nhẹ (xuất hiện rải rác)

 Cấp 2: Trung bình (phân bố dưới 1/3 cây)

 Cấp 3: Nặng (phân bố trên 1/3 cây)

- Chỉ tiêu theo dõi bệnh hại

Tỷ lệ cây bị bệnh (%): số cây bị bệnh/tổng số cây trồng thí nghiệm.

- Chỉ tiêu theo dõi mức độ khô đầu lá

Mức độ khô đầu lá được phân cấp dựa vào tỷ lệ chiều dài vết cháy so với chiều dài lá:

 Cấp 1: < 1% chiều dài lá bị hại

 Cấp 3: 1 đến 5% chiều dài lá bị hại

 Cấp 5: > 5 đến 25% chiều dài lá bị hại

 Cấp 7: > 25 đến 50% chiều dài lá bị hại

 Cấp 9: > 50% chiều dài lá bị hại

3.5.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền các giống lay ơn nghiên cứu

- Phân nhóm các giống lay ơn dựa vào hình thái

Hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp UPGMA trong NTSYSpc 2.1 được sử dụng để phân tích, đánh giá sự đa dạng di truyền và phân nhóm (cây di truyền) các mẫu giống lay ơn nghiên cứu. Các tính trạng đặc trưng được sử dụng là dài lá, số lá, thế lá, dài cành hoa, dài đoạn mang hoa, đường kính cành hoa, số hoa/cành, đường kính hoa, số củ bi/củ, mức độ khô đầu lá.

- Phân nhóm các giống lay ơn dựa vào chỉ thị phân tử ISSR

Quy trình tách chiết và tinh sạch ADN tổng số áp dụng theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) của Doyle & Doyle (1990).

Kỹ thuật PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 10µl hỗn hợp gồm 1µl ADN mẫu; 2µl H2O; 5µl PCR Master Mix 2x; 2µl mồi. Nồng độ ADN mẫu là 10ng và nồng độ mồi là 1uM. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR như sau:

(1) 950C trong 3 phút, (2) 940C trong 30 giây, (3) 530C trong 30 giây, (4) 720C

trong 30 giây, 30 chu kỳ lặp lại từ (2) đến (4); (5) 720C trong 7 phút và sau đó được giữ lạnh ở 40C.

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. Soi gel dưới đèn tử ngoại và ghi nhận các băng ADN phát sáng. Kích thước các băng ADN khuếch đại được xác định dựa trên thang chuẩn 1kb Plus DNA Ladder.

Phân tích kết quả: Từ hình ảnh điện di sản phẩm PCR_ISSR, số liệu theo quy ước (1): phân đoạn DNA xuất hiện và (0): phân đoạn DNA không xuất hiện. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của mỗi chỉ thị ISSR được xác định

theo công thức: PIC = 1 - ∑Pij2, trong đó Pij là tần số allele thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Lập biểu đồ hình cây theo phương pháp của Nei & Li (1979) trong phần mềm NTSYS 2.1.

3.5.1.3. Ước lượng các tham số di truyền và mối tương quan giữa các tính trạng đặc trưng của hoa lay ơn

Nghiên cứu được tiến hành bằng việc theo dõi 8 tính trạng số lượng quan trọng của 25 mẫu giống hoa lay ơn: số lá trên cây (lá), chiều dài lá (cm), chiều dài cành hoa (cm), đường kính cành hoa (cm), chiều dài đoạn cành mang hoa (cm), số hoa/cành (hoa), đường kính hoa (cm), số củ con/cây (củ).

Hệ số biến động kiểu gen (GCV) và hệ số biến động kiểu hình (PCV) được

tính theo công thức: ;

Hệ số di truyền theo nghĩa rộng: H2b = x 100.Trong đó: Phương sai môi trường σ2e=MSE/r, phương sai kiểu gen , MSg: bình phương trung bình kiểu gen, Mse: bình phương trung bình sai số, r: nhắc lại, phương sai kiểu hình σ2p = σ2g+ σ2e.

Tiến bộ di truyền được tính theo Johnson & cs. (1955): GA = k.H2b × σp;

tiến bộ di truyền theo phần trăm trung bình: GAM (%) = . Trong đó,

H2b: Hệ số di truyền theo nghĩa rộng, σp: độ lệch chuẩn kiểu hình, k: cường độ chọn lọc, ở áp lực chọn lọc 5% k = 2,06.

Hệ số tương quan được tính toán sử dụng phân tích tương quan và hồi quy tất cả các tính trạng thành phần bằng phần mềm SPSS ver 20.

Hệ số đường được phân tích theo phương pháp của Dewey & Lu (1959) và hướng dẫn của Akintundep (2012):

Po1 + Po2r12 + ……………… .Popr1p = ro1 Po2 + Po1r12 + ……………… .Popr2p = ro2 Pop + Po2r2p + ……………… Po1r1p = rop Trong đó:

Po1, Po2 …………… .. Pop là các hiệu ứng trực tiếp của các biến 1,2 ….p lên biến „0‟.

r12, r13 ……… .r1p ……… .rp (p-1) là các hệ số tương quan giữa các biến độc lập.

ro1, ro2 ……… .rop là tương quan của các biến độc lập với biến phụ thuộc. Tác động gián tiếp của biến thứ i thông qua biến thứ j được tính là (Poj x rij).

3.5.1.4. Khảo sát đặc điểm hình thái, sức sống và chất lượng hạt phấn hoa lay ơn

- Thí nghiệm 1: Đặc điểm hình thái bao phấn và hạt phấn của các mẫu giống hoa lay ơn

Thí nghiệm được tiến hành trên 25 mẫu giống hoa lay ơn. Bao phấn của mỗi mẫu giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngày, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi giống thu 90 bao phấn ở các vị trí hoa ngẫu nhiên, chia vào các đĩa petri có đánh số. Sau khi bao phấn bung ra, tiến hành đo kích thước và kiểm tra độ hữu dục của hạt phấn.

Đo kích thước hạt phấn: Hạt phấn được nhuộm bằng dung dịch KI - I2 1%. Quan sát hạt phấn dưới kính hiển vi quang học 10X (độ phóng đại 100 lần) có trắc vi thị kính. Sử dụng trắc vi vật kính để quy đổi đơn vị tính. Mỗi giống tiến hành đo kích thước của 30 hạt phấn.

Xác định độ hữu dục hạt phấn: Nhuộm hạt phấn với dung dịch KI - I2 1%. Sau đó cho lên tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi quang học. Mỗi tiêu bản chọn ngẫu nhiên 3 vi trường để quan sát dưới vật kính 4X (độ phóng đại 40 lần). Các hạt phấn bắt màu đậm là các hạt phấn hữu dục, các hạt phấn không bắt màu hoặc bắt màu nhạt là các hạt phấn bất dục.

- Thí nghiệm 2: Nhiệt độ bảo quản và sức sống của hạt phấn hoa lay ơn

Thí nghiệm được tiến hành trên hạt phấn của 5 mẫu giống lay ơn: GL1, GL2, GL3, GL6, GL24 đại diện cho các mẫu giống trong tập đoàn (các giống lai của cùng một loài). Thí nghiệm gồm 3 công thức được bố trí tuần tự không nhắc lại. Mỗi công thức tiến hành bảo quản hạt phấn trên 10 đĩa petri/ mẫu giống.

CT1: Bảo quản ở nhiệt độ 25 - 27oC CT2: Bảo quản ở nhiệt độ 7 - 9oC

CT3: Bảo quản ở nhiệt độ -15 - (-17)oC

Cách tiến hành: Bao phấn của mỗi mẫu giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngày, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi

giống thu 90 bao phấn ở các vị trí hoa ngẫu nhiên, chia vào các đĩa petri có đánh số. Sau khi bao phấn bung ra, hạt phấn được cho vào bảo quản ở các chế độ nhiệt khác nhau. Ở các công thức bảo quản lạnh, đĩa petri sau khi được quấn parafin, được bọc thêm túi nilon để tránh thay đổi độ ẩm.

Định kỳ 5 ngày theo dõi hạt phấn hữu dục bằng dung dịch KI - I2 1%, thử sức nảy mầm và đo kích thước hạt phấn. Sử dụng môi trường thử sức nảy mầm hạt phấn là: 300 mg/l Ca(NO3)2.2H2O + 200 mg/l MgSO4.7H2O + 100 mg/l KNO3 + 6,5 g/l agar + 100 mg/l axit Boric + 15 g/l Đường.

- Thí nghiệm 3: Vị trí lấy phấn và chất lượng hạt phấn

Thí nghiệm được tiến hành trên hạt phấn của 5 mẫu giống lay ơn: GL1, GL2, GL3, GL6, GL24 đại diện cho các giống trong tập đoàn (các giống lai của cùng một loài).Thí nghiệm gồm 3 công thức được bố trí tuần tự không nhắc lại . Mỗi công thức tiến hành trên 90 bao phấn/giống chia vào 10 đĩa petri có bao màng paraffin.

CT1: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 1 & 2 từ gốc cành (2 hoa đầu) CT2: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 3 & 4 từ gốc cành (2 hoa giữa) CT3: Hỗn hợp phấn của 2 bông hoa thứ 5 & 6 từ gốc cành (2 hoa cuối)

Cách tiến hành: Bao phấn của mỗi giống được thu trước khi hoa nở 1 - 2 ngày, để ở phòng có nhiệt độ 25 - 27oC, độ ẩm không khí 40 - 50%. Mỗi mẫu giống thu 90 bao phấn ở các vị trí hoa khác nhau, chia vào các đĩa petri có đánh số. Sau khi bao phấn bung ra, hạt phấn được kiểm tra độ hữu dục bằng dung dịch KI - I2 1% và thử sức nảy mầm. Sử dụng môi trường thử sức nảy mầm hạt phấn là: 300 mg/l Ca(NO3)2.2H2O + 200 mg/l MgSO4.7H2O + 100 mg/lKNO3 + 6,5

g/l agar + 100 mg/l axit Boric + 15 g/l Đường.

* Chỉ tiêu theo dõi

- Màu sắc bao phấn quan sát bằng mắt thường

- Chiều dài bao phấn trung bình (cm) = Tổng chiều dài bao phấn/số bao phấn theo dõi

- Đường kính bao phấn trung bình (mm) = Tổng đường kính bao phấn/số bao phấn theo dõi

- Thời điểm bung phấn tự nhiên (ngày) được xác định khi hạt phấn bắt đầu được giải phóng ra ngoài trên cây.

- Thời gian bung phấn sau thu (giờ): được tính bắt đầu từ khi thu đến khi bao phấn nứt và hạt phấn bắt đầu được giải phóng ra ngoài

- Tỷ lệ bao phấn mở (%) = (Số bao phấn mở /tổng số bao phấn theo dõi) x 100

- Tỷ lệ bao phấn dị hình (%) = (Số bao phấn dị hình /tổng số bao phấn theo dõi) x 100

- Chiều dài hạt phấn trung bình (µm) = Tổng chiều dài hạt phấn/số hạt phấn theo dõi

- Chiều rộng hạt phấn trung bình (µm) = Tổng chiều rộng hạt phấn/số hạt phấn theo dõi

- Tỷ lệ D/R = Chiều dài hạt phấn trung bình/chiều rộng hạt phấn trung bình

- Tỷ lệ hữu dục (%) = (Số hạt phấn hữu dục /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100

- Tỷ lệ hạt phấn nảy mầm (%) = (Số hạt phấn nảy mầm /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100

- Chiều dài ống phấn trung bình (µm) = Tổng chiều dài ống phấn/số hạt phấn theo dõi

- Tỷ lệ hạt phấn chết (%) = (Số hạt phấn chết /tổng số hạt phấn theo dõi) x 100.

3.5.2. Lai hữu tính tạo quần thể lai

Trong giai đoạn nghiên cứu của đề tài, tiến hành lai hữu tính 14 tổ hợp: áp dụng phương pháp lai đơn ngẫu nhiên trong các mẫu giống bố/mẹ được chọn, mỗi tổ hợp lai tiến hành lai 10 hoa. Định hướng lai tạo: giống mới có màu sắc đẹp, cành hoa dài > 100 cm, số hoa/cành > 12 hoa, ít mẫn cảm với khô đầu lá.

Bảng 3.3. Danh sách các tổ hợp lai hoa lay ơn được thực hiện

♀	♂	Kí hiệu	TT	♀	♂	Kí hiệu
1	GL1	GL2	15A01	8	GL6	GL1	15A08
2	GL2	GL1	15A02	9	GL3	GL1	15A09
3	GL2	GL3	15A03	10	GL3	GL2	15A10
4	GL2	GL7	15A04	11	GL3	GL7	15A11
5	GL2	GL10	15A05	12	GL7	GL1	15A12
6	GL2	GL6	15A06	13	GL7	GL2	15A13
7	GL6	GL2	15A07	14	GL1	GL20	15A14

Cách tiến hành: trước khi lai 2 - 3 ngày, bao phấn từ hoa bố được thu và bảo quản trong hộp petri ở điều kiện thường, khô, thoáng, không có ánh sáng trực