Nhân Giống Hoa Lay Ơn Bằng Phương Pháp Nuôi Cấy Mô Tế Bào

vật liệu nhân giống đa dạng có thể từ củ, lá, nụ, cuống hoa… có thể tạo ra giống mới, tạo được cây con sạch bệnh virus, khống chế được các điều kiện nuôi cấy, chủ động về giống, tiết kiệm đất, lao động và thời gian.

a. Nghiên cứu về chủng loại mẫu cấy

Để quá trình nhân giống in vitro có thể thu được sản phẩm nhanh chóng, khoẻ mạnh, đồng nhất thì nguồn mẫu đưa vào cũng rất quan trọng. Nguồn mẫu cấy dùng trong nhân giống lay ơn bằng nuôi cấy mô rất phong phú: củ thương phẩm, củ con, lá, cuống hoa, đĩa gốc… Hai đường hướng được sử dụng trong nhân giống in vitro lay ơn là tái sinh chồi trực tiếp và gián tiếp thông qua cảm ứng hình thành callus.

Priyakumari & Sheela (2005) đã nhân giống Gladiolus grandiflorus L. Cv” Peach Blossom” sử dụng mẫu cấy là chồi của củ con có đường kính 0,8 - 2,1cm. Môi trường thích hợp để phát sinh chồi là MS + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l α- NAA.

Một phương pháp nhân giống in vitro đã được phát triển cho giống lay ơn sử dụng các phần của củ giống. Callus được hình thành trong các môi trường nuôi cấy sau 3 - 5 tuần từ lát giữa và dưới của củ con giống White Friendship và Peter với tỷ lệ hình thành callus cao nhất là 72,5% được quan sát thấy trên môi trường MS được bổ sung 4 mg/l α-NAA. Mẫu cấy hình thành callus tốt nhất là lát cắt phần dưới của củ giống White Friendhsip (Memon & cs., 2014).

Kabir & cs. (2014) cũng đã nhân giống thành công giống hoa lay ơnGladiolus dalenii sử dụng lát cắt củ làm mẫu cấy. Kết quả cho thấy 90% mẫu cấy hình thành callus trên môi trường MS + 7,5 mg/l α-NAA sau 90 ngày nuôi cấy. Số chồi/mẫu cấy khoảng 20 chồi khi chuyển sang môi trường MS + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin. Tương tự, Tripathi & cs. (2017) cũng nghiên cứu vào mẫu giống hoa lay ơn bằng lát cắt củ thương phẩm trên môi trường MS + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4-D + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar.

Chồi chính của củ bi cũng được Devi & cs. (2019) sử dụng làm vật liệu nhân giống in vitro của 3 giống lay ơn Sylvia, White Prosperity và Amsterdam theo đường hướng tạo callus  phản phân hóa  tạo chồi  tạo cây. Môi trường để tạo callus là MS + 2 mg/l 2,4D.

b. Nghiên cứu về phương pháp khử trùng mẫu cấy

Nghiên cứu của Priyakumari & Sheela (2005) cho thấy cần xử lý củ giống bằng thuốc trừ nấm trước. Củ con của giống Gladiolus ‘Peach Blossom được xử

lý với Mancozeb (Indofil M-45) 0,4% trong 30 phút. Củ con còn nguyên vẹn có kích thước 0,8 - 2,1 cm được ngâm trong dung dịch Labolene pha loãng 1000 lần trong 30 phút và rửa sạch dưới vòi nước chảy (5 phút), tiếp theo là tráng lại nước cất. Các củ con được khử trùng bề mặt cuối cùng trong buồng cấy vô trùng với 0,08% HgCl2 (10 phút) và được rửa bằng nước cất vô trùng 4 -5 lần.

Theo nghiên cứu của Kabir & cs. (2014) khử trùng theo cách sau giúp cho mẫu cấy là lát cắt củ sạch và vẫn đảm bảo hình thành callus đến 90%: Lớp vỏ ngoài được loại bỏ khỏi củ và sau đó rửa sạch với chất tẩy rửa "Trix" và xả trong 20 phút dưới vòi nước chạy để loại bỏ bụi bẩn và sinh vật. Sau đó sử dụng HgCl2 0,1% kèm 2 giọt Tween 20 trong 10 phút trong điều kiện vô trùng. Rửa lại 4 lần với nước cất vô trùng.

Đối với mẫu cấy là chồi chính của củ bi, Kumar & cs. (2018) và Devi & cs, (2019) đều khẳng định biện pháp khử trùng bằng rửa bề mặt bằng Tween 20, sau đó khử trùng trong tủ cấy bằng cồn 70% 4 - 5 phút và HgCl2 0,1% trong 10 phút cho hiệu quả vào mẫu cao.

c. Nghiên cứu về môi trường nhân nhanh

Năm 2005, Priyakumari & Sheela đã tiến hành thí nghiệm trên giống “Peach Blossom”, kết quả chỉ ra ở nồng độ BAP (1 - 2 mg/1) thích hợp với việc nhân nhanh chồi. Tái sinh chồi hiệu quả từ callus cũng được quan sát thấy khi tăng BAP từ 2 đến 4 mg/l và có tỷ lệ 92,92% và số chồi (18,25) (Memon & cs., 2014). Tương tự, Tripathi & cs. (2017) và Ashkaneh & cs. (2020) cũng nghiên cứu nhân nhanh giống hoa lay ơn trên môi trường có bổ sung 2 - 3 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-NAA cho hiệu quả nhân giống cao.

Kumar & cs. (2018) đã tiến hành nhân nhanh giống White prosperity trên 2 môi trường thử nghiệm là MS và Gamborg (B5) bổ sung 0 - 4 mg/l BAP. Kết quả thu được môi trường B5 hiệu quả hơn môi trường MS thể hiện ở số lượng chồi thay đổi từ 1,3 - 3,0 chồi/mẫu trên môi trường B5 và 0,6 đến 2,3 chồi/mẫu trên môi trường MS. Sau 30 ngày cấy, chiều cao chồi từ 2,2 - 3,8 cm trong môi trường B5 và 1,1 - 2,9 cm trong MS.

Hiệu quả của BAP trong môi trường nhân nhanh giống hoa lay ơn được khẳng định qua nghiên cứu của Manviya & cs. (2018) với 89% phát sinh chồi, 19,32 chồi/mẫu. Môi trường nhân nhanh MS bổ sung 2 mg/l BAP cho hiệu quả

cao khi tiến hành nhân nhanh giống lay ơn Sylvia, White Prosperity và Amsterdam với số chồi tạo ra tương ứng là 9,2; 2,3; 3,4 chồi/mẫu (Devi & cs., 2019).

d. Nghiên cứu về môi trường tạo củ

Nghiên cứu của Emek & Erdag (2007) cho thấy củ con của giống Gladolus anatolicus (Boiss.) Stapf (Iridaceae) hình thành từ đế chồi được quan sát thấy ở môi trường MS cơ bản và không có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng.

Sự hình thành rễ đã giảm xuống trên môi trường bổ sung đường 7%. Củ con hình thành tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 5% sucrose và 1mg/l IBA (Memon & cs., 2014). Việc sử dụng 60 g/l sucrose trong môi trường MS cũng tạo ra số lượng củ con cao nhất (14 củ/mẫu) với kích thước lớn nhất (1,45 cm) (Ashkaneh & cs., 2020).

e. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy

Theo các kết quả mà Dantu & Bhojwani (1995) nghiên cứu được thì điều kiện tối đã ức chế sự hình thành củ, còn khi chiếu sáng thì không những kích thích chồi phát triển mà còn hình thành củ. Đồng thời ta cũng thấy rằng cường độ ánh sáng là 3000 lux thích hợp hơn cho cây hoa lay ơn trong việc hình thành củ. Vì ánh sáng đóng vai trò quan trong trong việc quang hợp tạo năng lượng tích luỹ, nên cường độ ánh sáng cao sẽ giúp cho chồi quang hợp mạnh hơn, tạo nhiều tinh bột hơn cho việc hình thành và tăng trưởng của củ.

Tác giả Antonio & cs. (2018) đã nghiên cứu nhân giống lay ơn Amsterdam trên môi trường MS rắn, bán lỏng trong hệ thống ngâm tạm thời và lỏng trong lò phản ứng sinh học. Kết quả thu được số lượng chồi tạo ra lớn 41,3 ở điều kiện lò phản ứng sinh học và điều kiện khác từ 5,8 - 6,5 chồi/mẫu.

2.6.2. Nhân giống hoa lay ơn ở Việt Nam

2.6.2.1. Nhân giống hoa lay ơn bằng hạt

Quả lay ơn được hình thành sau khi lai tạo hoặc thụ phấn tự do, khi thấy quả chuyển sang màu vàng khô, thu hạt, phơi 1 -2 nắng nhẹ. Hạt gieo sẽ cho ra loại củ nhỏ, dùng củ nhỏ đem trồng sẽ được củ nhỡ, tiếp tục đem trồng sẽ thu được củ to và sau đó thu hoa (Đinh Thế Lộc & Đặng Văn Đông, 2004). Ở Việt Nam, cách gieo hạt này cây con trải qua thời gian dài mới ra hoa và tỷ lệ ra hoa thấp nên không thích hợp cho trồng ở vùng Đồng bằng sông Hồng, vì vậy phương pháp này ít phổ biến.

Phương pháp này cây con thường không giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ, do đó người ta chỉ sử dụng phương pháp này để lai tạo giống mới và phục tráng giống. Do vậy trong sản xuất hoa thương phẩm thường không sử dụng phương pháp này mà sử dụng trong công tác lai tạo giống mới, hoặc phục tráng giống.

2.6.2.2. Nhân giống hoa lay ơn bằng củ

Mỗi cây thu 1 củ lớn, 4 - 5 củ nhỡ, 10 - 30 củ nhỏ tùy giống. Thu xong phân loại theo kích cỡ, để nơi khô ráo, thoáng mát. Củ được bảo quản trên những giàn, trong các khay gỗ hoặc sàng loại to. Một số giống cần được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 3 - 40C, độ ẩm không khí 75 - 80% trong vòng 2 tháng. Đối với các củ nhỡ phải trồng qua 1 vụ, củ nhỏ 2 vụ để phát triển thành củ lớn mới trồng lấy hoa thương phẩm được (Đinh Thế Lộc & Đặng Văn Đông, 2004).

Năm 2012, Viện Nghiên cứu Rau quả đã xây dựng được quy trình nhân giống hoa lay ơn đỏ 09 bằng củ. Kết quả nhân giống bằng củ cho thấy: Thời vụ nhân giống lay ơn tại Mộc Châu tốt nhất là 25/1 - 25/2; từ củ lay ơn ban đầu có chu vi 2 – 4 cm, sau 135 ngày trồng sẽ thu được củ thương phẩm có chu vi 8 – 12 cm. Điều kiện bảo quản củ tốt nhất là 4 - 5oC, độ ẩm 65% trong thời gian 105 ngày (Trịnh Khắc Quang, 2012).

2.6.2.3. Nhân giống hoa lay ơn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

a. Nghiên cứu về mẫu cấy

Trong nuôi cấy mô thì kỹ thuật nuôi cấy lát cắt của các cơ quan, bộ phận hiện nay rất được chú trọng nhân giống như nuôi cáy lát cắt củ, lát cắt vảy củ, lá, đoạn thân… với hệ số nhân rất cao, gấp 5 - 7 lần so với phương pháp thông thường. Đây là kỹ thuật tạo cơ quan bất định, liên quan đến việc điều khiển kích thước mẫu ban đầu để cảm ứng và tối ưu hoá quy trình tái sinh ở thực vật (Nhut D.T. & cs., 2004).

Cơ quan nuôi cấy hiệu quả là chồi chính. Khi sử dụng chồi chính nuôi cấy, thời gian bật chồi nhanh hơn, số chồi tạo được nhiều hơn so với việc sử dụng cơ quan nuôi cấy là mắt ngủ (Lê Thị Thu Hương, 2012).

b. Nghiên cứu về biện pháp khử trùng mẫu cấy

Củ giống được rửa bằng xà phòng rồi xả dưới vòi nước chảy nhiều lần. Sau đó mẫu được xử lý với ethanol 70% trong 30 giây và rửa lại 1 lần bằng nước cất

vô trùng. Tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 20 phút, trong thời gian khử trùng lắc đều mẫu, sau đó rửa lại 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng cho hiệu quả khử trùng cao (Nông Thị Huệ & Nguyễn Thị Phương Thảo, 2010).

Khử trùng mẫu bằng H2O2 30% trong thời gian 25 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống thấp, tỷ lệ mẫu sống sạch đạt 87% (Lê Thị Thu Hương, 2012).

c. Nghiên cứu về môi trường tạo củ

Trong nhân giống in vitro, nồng độ sucrose ảnh hưởng rất lớn đến sự hình hành củ và chất lượng củ in vitro. Số củ/ mẫu tỷ lệ thuận với nồng độ đường. Ngoài ra môi trường có hàm lượng sucrose cao giúp tạo củ với trọng lượng tươi cao. Nồng độ đường cao trong môi trường giúp tăng khả năng tích luỹ tinh bột trong củ. Ở nồng độ đường thấp, khả năng tích luỹ tinh bột thấp dẫn đế sự hình thành củ bị hạn chế và trọng lượng tươi của củ thấp, nồng độ thích hợp nhất là 60 – 80 g/1 (Dương Tấn Nhựt & cs., 2007).

Năm 2010, Nông Thị Huệ & Nguyễn Thị Phương Thảo nghiên cứu tạo củ trên giống lay ơn Cartago, kết quả đã xác định được môi trường tạo củ thích hợp cho mô nuôi cấy là MS + 70 g/l sucrose + 1 mg/l IBA.

Đối với giống lay ơn đỏ 09, môi trường tạo củ MS + 60 g/l saccarose + 1 mg/l α-NAA; củ con thu được có chu vi 1,4 - 1,6 cm (Lê Thị Thu Hương, 2012).

d. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy

Một yếu tố cũng không thể thiếu trong nhân giống cây trồng nói chung đặc biệt là vi nhân giống đó là điều kiện sáng. Đối với lay ơn thì sự phát triển của hoa và củ chịu ảnh hưởng mạnh mẽ của quang chu kỳ. Trong nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng điều kiện ngày ngắn là nguyên nhân làm giảm kích thước và trọng lượng củ (Dương Tấn Nhựt & cs., 2007). Còn trong nhân giống in vitro thì phản ứng tạo củ trong điều kiện chiếu sáng và trong tối là như nhau.

Nền môi trường đặc thích hợp với tạo củ in vitro hoa lay ơn Cartago, cho tỷ lệ hình thành củ từ cụm chồi đạt 100%, củ có chất lượng tốt, hệ số tạo củ cao nhất so với các kiểu nuôi cấy khác (bán lỏng, lỏng, lỏng lắc), đạt 4,38 củ/mẫu (Nông Thị Huệ & Nguyễn Thị Phương Thảo, 2010).

2.7. KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Các giống lay ơn trồng hiện nay có nền di truyền phức tạp và là kết quả của nhiều phép lai. Việc nghiên cứu tạo giống lay ơn mới trên thế giới chủ yếu được

thực hiện thông qua lai hữu tính trên nền các giống lai hiện đại theo các bước: đánh giá nguồn gen, lai hữu tính, chọn lọc dòng, nhân giống vô tính.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên đối tượng hoa lay ơn đã được thực hiện là tuyển chọn giống nhập nội, kỹ thuật trồng, chăm sóc và nhân giống vô tính. Các giống lai tạo ra với số lượng ít và chưa được phát triển ngoài sản xuất vì chất lượng các giống mới này chưa đáp ứng được yêu cầu của sản xuất và quá trình nhân giống cho các giống này chưa được tối ưu. Các nghiên cứu về di truyền tính trạng ở hoa lay ơn cũng chưa được tiến hành.

Trên thế giới, nghiên cứu về hiện tượng khô đầu lá ở hoa lay ơn mới chỉ tập trung vào sử dụng các giống hoa này trong đánh giá mức độ ô nhiễm Flo mà chưa có nghiên cứu nào công bố về việc chọn tạo các giống lay ơn mới không/ít mẫn cảm với khô đầu lá. Ở Việt Nam, khô đầu lá là một vẫn đề lớn gây tổn hại đến sản xuất hoa lay ơn nhưng hướng giải quyết vẫn là tuyển chọn các giống nhập nội thích hợp và ít mẫn cảm.

Từ những vấn đề trên, định hướng nghiên cứu được đề ra là đề tài sẽ tập trung nghiên cứu đánh giá nguồn gen được sử dụng làm nguồn vật liệu cho tạo giống lay ơn thông qua đánh giá kiểu hình, đánh giá đa dạng di truyền, các thành phần di truyền, mối tương quan giữa các tính trạng và đường hướng tương tác giữa các tính trạng đến năng suất, chất lượng hoa và mức độ mẫn cảm với khô đầu lá. Thông qua lai hữu tính, chọn tạo được các dòng lai lay ơn mới có chất lượng cao và ít mẫn cảm với khô đầu lá.

Đề tài tiếp cận phương pháp nhân giống các giống mới tạo ra thông qua nuôi cấy mô tế bào nhằm rút ngắn thời gian tạo giống, nhân giống, tăng hệ số nhân, chất lượng củ giống hoa lay ơn.

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu nguồn vật liệu, lai tạo, đánh giá, chọn lọc dòng lai hoa lay ơn mới được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh, Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội.

- Trồng thử nghiệm các dòng lai hoa lay ơn mới tại 3 địa phương: Gia Lâm

- Hà Nội, An Dương - Hải Phòng, Dĩnh Trì - Bắc Giang.

- Nghiên cứu về nhân giống các dòng lai: giai đoạn trong phòng thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh; giai đoạn tạo củ thương phẩm ngoài đồng ruộng thực hiện tại Khu nông nghiệp công nghệ cao - Bản Bó Bun, thị trấn nông trường Mộc Châu, Sơn La.

3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được triển khai từ vụ Đông Xuân 2015 - 2016 đến vụ Đông Xuân 2019 - 2020 được cụ thể theo sơ đồ sau:

Đánh giá nguồn vật liệu tạo giống, lai tạo

Vụ Đông Xuân 2015 - 2018

 Đánh giá đặc điểm nông sinh học, đa dạng di truyền của 25 mẫu giống lay ơn

 Ước lượng các tham số di truyền, tương tác của các tính trạng liên quan đến chất lượng hoa

 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và bảo quản hạt phấn

 Lai hữu tính 14 tổ hợp lai

Đánh giá quần thể lai

Năm 2016 - 2018

 Đánh giá và sàng lọc các cá thể lai qua hình thái, tách 238 dòng lai

 Nghiên cứu BPKT nhân giống dòng lai mới tạo ra

 Chọn lọc 25 dòng lai ưu tú

Đánh giá, tuyển chọn dòng lai

Vụ Đông Xuân 2018 - 2019

 Đánh giá 25 dòng lai ưu tú, chọn lọc 3 dòng lai triển vọng

Trồng thử nghiệm 3 dòng lai triển vọng tại các địa phương

Vụ Đông Xuân 2019 - 2020 Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Giang

3 Giống triển vọng

3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1. Các mẫu giống hoa lay ơn sử dụng làm vật liệu

Đề tài được tiến hành trên tổng số 25 mẫu giống hoa lay ơn (21 mẫu giống từ Hà Lan, 1 mẫu giống từ Hải Phòng và 3 giống từ Bắc Giang) được thu thập năm 2014 (Bảng 3.1). Tất cả các mẫu giống thí nghiệm có chu vi củ 10 - 12 cm, đã được xử lý phá ngủ.

Bảng 3.1. Danh sách các mẫu giống lay ơn nghiên cứu

Mẫu giống	Tên la tinh	Kí hiệu	Màu sắc hoa	Nguồn gốc
1	Advance	G.hybridus cv. Advance	GL1	Đỏ tươi	Hà Lan
2	Trắng Hải Phòng	G.hybridus Hort.	GL2	Trắng	Việt Nam
3	Cha Cha	G.hybridus cv. Chacha	GL3	Vàng	Hà Lan
4	Blues	G.hybridus cv. Blues	GL4	Tím nhạt	Hà Lan
5	Flevo eyes	G.hybridus cv. Flevo eyes	GL5	Trắng chấm đỏ	Hà Lan
6	PR Margareth rose	G.hybridus cv. PR margareth rose	GL6	Vàng viền đỏ /song sắc	Hà Lan
7	San Remo	G.hybridus cv. San remo	GL7	Hồng	Hà Lan
8	Priscilla	G.hybridus cv. Priscilla	GL8	Trắng viền hồng	Hà Lan
9	Union point	G.hybridus cv. Union point	GL9	Đỏ tím	Hà Lan
10	Cartago	G.hybridus cv. Cartago	GL10	Đỏ thẫm	Hà Lan
11	Reve D‟amour	G.hybridus cv. Reve d‟amour	GL11	Hồng sen	Hà Lan
12	Pink Soledo	G.hybridus cv. Pink soledo	GL12	Phấn hồng	Hà Lan
13	Limoncello	G.hybridus cv. Limoncello	GL13	Vàng	Hà Lan
14	Chinon	G.hybridus cv. Chinon	GL14	Đỏ tươi	Hà Lan
15	Algarve	G.hybridus cv. Algarve	GL15	Trắng sữa	Hà Lan
16	Greenstar	G.hybridus cv. Greenstar	GL16	Xanh ngọc	Hà Lan
17	Blackstar	G.hybridus cv. Blackstar	GL17	Đỏ tím	Hà Lan
18	Mascagnir	G.hybridus cv. Mascagnir	GL18	Đỏ	Hà Lan
19	Internet	G.hybridus cv. Internet	GL19	Đỏ cờ	Hà Lan
20	ĐTVBG	G.hybridus Hort.	GL20	Đỏ tươi	Việt Nam
21	HĐTBG	G.hybridus Hort.	GL21	Hồng	Việt Nam
22	CALBG	G.hybridus Hort.	GL22	Tím hồng	Việt Nam
23	Flevo sourvenir	G.hybridus cv. Flevo sourvenir	GL23	Vàng	Hà Lan
24	Monte Alto	G.hybridus cv. Monte alto	GL24	Hồng	Hà Lan
25	Amsterdam	G.hybridus cv. Amsterdam	GL25	Trắng	Hà Lan