Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá Muntingia calabura L. - 2

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn 5

Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes 10

Hình 2.3. Cây trứng cá 12

Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá 13

Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá 23

Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ

.......................................................................................................................................26

Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết 29

Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm 31

Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple. 33

Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi 33

Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn 134N 34

Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn 134N 34

Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn 134N 35

Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N 35

Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml. 37

Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml 38

Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BHI

Brain Heart Infusion Broth
DMSO	Dimethyl Sulfoxide
DNA	Deoxyribo Nucleic Acid
DPPH	2,2-diphenylpicrylhydrazyl
ED50	Effective dose 50
IC50	Inhibitory concentration
M. calabura	Muntingia calabura L.
MIC	Minimum inhibitory concentration
MBC	Minimum bactericidal concentration
P. acnes	Proipionibacterium acnes
TYEG	Tryticase-Yeast extract-Heart extract-Glycerol
v/v	Volume per volume
w/v	Weight per volume

Có thể bạn quan tâm!

• Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá Muntingia calabura L. - 1
• Cơ Chế Gây Bệnh Trứng Cá Vi Khuẩn Propionibacterium Acnes
• Tình Hình Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Cao Chiết Từ Cây Trứng Cá Trong Và Ngoài Nước
• Nuôi Cấy Và Nhận Diện Dòng Vi Khuẩn Propionibacterium Acnes

Xem toàn bộ 89 trang tài liệu này.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da mặt, lưng và ngực. Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý, thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân. Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh hay hen suyễn (Mallon et al., 1999). Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm (Park et al., 2004). Vi khuẩn P. acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002). Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được vi khuẩn P. acnes (Nguyễn Thanh Hùng, 2013)

Kháng sinh, retinoid và một số chất khác như benzoyl peroxid, acid salicylic, acid azelaic và anpha-hydroxy cho tác dụng điều trị bệnh trứng cá thông thường (Leyden, 2003). Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da, lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003). Vì vậy việc tiếp cận các liệu pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn là rất cần thiết.

Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á. Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk et al., 2005). Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin, 1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm.

Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cáPropionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau:

1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)

2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ

Bệnh trứng cá được mô tả sớm nhất trong các bài viết Hy Lạp cổ đại của bác sĩ Byzantine Aetius Amidenus. Từ “acne” xuất phát từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành acne và được sử dụng đến ngày nay (Humgara et al., 2013).

Bệnh trứng cá là bệnh về da phổ biến nhất đặc biệt ở lứa tuổi thanh thiếu niên. Bệnh trứng cá không thể định nghĩa là bệnh truyền nhiễm vì vi khuẩn gây mụn không chỉ hiện diện trên da người bệnh mà còn trên da người khoẻ mạnh. Bệnh trứng cá được hình thành do sự tăng tiết chất nhờn, tế bào phễu bị sừng hoá làm tắc nghẽn cổ nang lông, sự gia tăng mật độ vi khuẩn bên trong nang lông và sử dụng tế bào chết cùng với chất nhờn phát triển tạo thành nhân mụn nhỏ (microcomedone) không thể phát hiện bằng mắt thường (Plewig và Kligman, 2000)

2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá

Theo Phạm Hoàng Khâm (2011) bệnh trứng cá được chia thành 2 dạng là tổn thương không viêm như mụn đầu trắng (whitehead) và mụn đầu đen (blackhead) và dạng viêm bao gồm sẩn, mụn mủ, mụn bọc, mụn nang.

- Mụn đầu đen hình thành do chất bã bài tiết và tế bào chết làm tắc lỗ nang lông nhưng bề mặt da hở nên nhân mụn bị không khí oxy hoá tạo màu đen. Nhìn vào nang lông thấy màu đen nên gọi là mụn đầu đen hay mụn có cấu trúc mở.

- Mụn đầu trắng hình thành khi có quá nhiều chất dầu và tế bào chết gây bít tắc lỗ nang lông và không hở ra da, nên gọi là “nhân đóng”.

Theo Hayashi et al., 2008 sử dụng hình thái và số lượng tổn thương phân chia bệnh thành 3 mức độ: nhẹ, trung bình và nặng

- Bệnh trứng cá nhẹ: từ 0 - 5 nốt viêm, thương tổn là một vài mụn đầu trắng, mụn đầu đen.

- Bệnh trứng cá trung bình: từ 6 - 20 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn đầu trắng, mụn đầu đen đồng thời có thêm sẩn, mụn mủ.

- Bệnh trứng cá nặng: từ 21 - 50 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn mủ, nang, nốt sẹo.

Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ:

- Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules)

- Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule)

- Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess)

- Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar)

2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá

Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật trên da và phản ứng viêm của tế bào chủ. Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là điều kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P. acnes đóng vai trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002). Ngoài ra còn các yếu tố khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí hậu, lạm dụng mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013)

2.1.2.1. Sự tăng sinh tiết bã nhờn

Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc biệt ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng bàn chân. Có hai quá trình liên quan đến sự tổng hợp chất béo của bã nhờn: quá trình tổng hợp triglycerid, acid béo tự do, wax ester, sterol ester và quá trình tổng hợp squalen và cholesterol (Downie et al., 2004). Hầu hết các tuyến bã nhờn đổ vào nang lông trên bề mặt da để giữ ẩm cho làn da. Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã nhờn tiết nhiều chất nhờn trên mức cần thiết. Chất nhờn sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn đến tắc lỗ chân lông hình thành nhân trứng cá. Thành phần chất nhờn trên da bệnh nhân bệnh trứng cá thường có squalen và wax ester cao hơn bình thường và các acid béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường. Sự thiếu hụt acid linileic là yếu tố quan trọng gây mụn trứng cá (Downie et al., 2004). Acid linoleic điều khiển quá trình tiết của interleukin (IL-8), gây ra phản ứng viêm (Zouboulis, 2001)

2.1.2.2. Rối loạn bong sừng (sự sừng hoá bất thường ở lỗ chân lông)

Rối loạn bong sừng là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần miệng lỗ chân lông kết chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành nhiều lớp tế bào chết xếp chồng lên nhau. Lớp tế bào chết này sẽ gây hẹp lỗ chân lông dẫn đến bít tắc lỗ chân lông tạo nên môi trường kỵ khí với nhiều chất nhờn thuận lợi cho vi khuẩn phát triển gây ra mụn (Thiboutot et al., 2009)

2.1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh trứng cá:

Các chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P. acnes được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996).

Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase. Trong

dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P. granulosum và P. avidum không có khả năng sinh tryptophan, trong khi P. acnes cho kết quả dương tính. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P. acnes (Kishishita et al., 1980).

2.1.2.4. Phản ứng viêm

Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các acid béo tự do và glycerol. Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông, thu hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977; Pawin et al., 1998)

Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007)

A. Nang tuyến bã nhờn bình thường B. Nhân mụn C. Nang bị vỡ do viêm

2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay

Bệnh trứng cá liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh nên điều trị phức tạp việc điều trị phải dựa trên từng cá thể bệnh mức độ trầm trọng của bệnh, nguyên nhân gây bệnh mà sử dụng thuốc tại chổ hay toàn thân hoặc kết hợp cả hai để đạt hiệu quả cao. Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng kể nhưng thời gian điều trị kéo dài và kèm theo tác dụng phụ không mong muốn.

2.1.3.1. Sử dụng kháng sinh

Theo một số phác đồ điều trị kháng sinh thường sử dụng là clindamycin, erythromycin, tetracylin.

- Dung dịch clindamycin 1 % có hiệu quả trong việc làm giảm vi khuẩn P.acnes (thường gặp ở vùng da nhờn), có tác dụng tốt đối với mụn mủ, sẩn mủ, nhưng với nang mụn và nhân mụn thì thuốc ít có hiệu quả.

- Dung dịch erythromycin 4 % có tác dụng giống clindamycin. Sau khi dùng khoảng 12 tuần, khoảng 2/3 bệnh nhân có kết quả tốt.

- Khi điều trị kháng sinh tại chỗ thất bại (6 - 8 tuần), nên phối hợp kháng sinh toàn thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin 500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2 lần/ngày.

Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes làm giảm viêm nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn (Shimonart và Dramaix, 2005). Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P. acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng kháng sinh của vi khuẩn P. acnes (Leyden, 1976). Năm 1979, Crawford cùng cộng sự đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P. acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ lệ mức 20 % .Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996. Theo một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P. acnes cao nhất với erythromycin và clindamycin. Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 %. Ở Hy Lạp, tỷ lệ P. acnes đề kháng cả hai loại erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002). Theo Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P. acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 %. Những loại kháng sinh điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000). Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc (Sheafer et al., 2001). Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan đến đột biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa Kỳ và Châu Âu (Ross et al., 2002). Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc nhóm macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin (Ross et al,. 2002). Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo phòng khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như sau lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %; minocyclin 0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các loại kháng sinh thường gây một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Vì vậy việc lựa chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và tuân thủ theo điều trị của thầy thuốc mới đạt kết quả mong muốn.