Tình Hình Nghiên Cứu Về Vi Sinh Vật Vùng Rễ Trên Cây Hồ Tiêu

orthoclase, biotite, fenspat, illite, mica) có trong đất dưới dạng cố định, không dễ sử dụng cho cây. Tương tự như vi khuẩn hòa tan phốt phát, một số vi sinh vật vùng rễ có khả năng hòa tan kali dạng khó tan thành dạng dễ hấp thu nhằm thúc đẩy sinh trưởng và năng suất của cây. PGPR hòa tan kali bằng nhiều cơ chế khác nhau như bài tiết axit hữu cơ, thải sắt, khử, phân ly, trao đổi và axit hóa để hòa tan kali [103]. Các chủng vi sinh vật khác nhau như Acidothiobacillus ferrooxidans, B. edaphicus, B. mucilaginosus, Burkholderia, Paenibacillus sp. và Pseudomonas sp. tham gia vào quá trình hòa tan kali. El-Hadad và cộng sự (2011) cũng đã ghi nhận tác động tích cực của vi khuẩn hòa tan kali đến sự phát triển của cây cà chua [102].

Sản xuất siderophore và amonia

Sắt là một yếu tố thiết yếu cho các sinh vật sống trong các quá trình hô hấp, vận chuyển điện tử, quang hợp, đồng yếu tố cho nhiều enzyme. Trong môi trường hiếu khí, sắt tồn tại ở dạng không hòa tan trong đất, không có sẵn cho các sinh vật sống. Ở điều kiện môi trường có hàm lượng sắt thấp, vi khuẩn vùng rễ đã hình thành cơ chế riêng nhằm loại bỏ sắt dạng không hòa tan bằng cách sản xuất các siderophores trọng lượng phân tử thấp [104]. Một số lượng lớn vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật bao gồm Aeromonas, Azadirachta, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia và Streptomyces sp. giúp sản xuất siderophores, vận chuyển sắt vào tế bào thực vật nhằm thúc đẩy tăng trưởng tốt hơn. El-Sayed và cộng sự (2014) đã báo cáo các hoạt động thúc đẩy tăng trưởng thực vật của Bacillus sp., Enterobacter sp. và Pseudomonas sp. cùng với hoạt tính kháng tuyến trùng [100]. Các hợp chất kích thích tăng trưởng thực vật tạo ra từ các chủng PGPR ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây chủ bằng cách tạo ra sự phân chia tế bào, phát triển mô, chuyển hóa các quá trình sinh lý và sinh hóa.

1.6. Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật vùng rễ trên cây hồ tiêu

1.6.1. Trên thế giới

Theo Li và cộng sự (2016), tất cả các thành phần dinh dưỡng của đất và các chỉ số đa dạng vi sinh vật trong đất tại vùng rễ cây hồ tiêu đều cao hơn so với đất không phải vùng rễ [105]. Các vi sinh vật tại vùng rễ trong đó có vi khuẩn vùng rễ được xem là đối tượng lý tưởng để sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học, vùng rễ như là tuyến đầu bảo vệ cho rễ chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Các mầm bệnh gặp phải sự đối kháng từ các vi sinh vật vùng rễ trước khi xâm nhập vào rễ và cả trong quá trình lây lan thứ cấp ở rễ [106]. Ở Malaysia, các bệnh quan trọng nhất trên

cây hồ tiêu bao gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora, bệnh chết chậm do Fusarium và bệnh lá nhỏ do virus. Nhiều nghiên cứu khác nhau được tiến hành nhằm đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh cũng như tuyến trùng sần rễ ký sinh thực vật (Meloidogyne sp.) của các chủng vi sinh vật vùng rễ đặc biệt là chi Bacillus và Pseudomonas trên nhiều loại cây trồng khác nhau, trong đó có cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro cũng như trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng [107].

Diby và cộng sự (2005) chứng minh 05 chủng Pseudomonas fluorescens và Trichoderma spp. từ vùng rễ cây hồ tiêu có khả năng đối kháng Phytophthora capsici bằng cơ chế tổng hợp enzyme β-1,3-glucanases, β-1,4-glucanases, lipases phân hủy thành tế bào nấm [108]. Zhang và cộng sự (2016) đã phân lập được 76 chủng vi khuẩn từ đất vùng rễ cây hồ tiêu [109]. Trong đó, tuyển chọn được 23 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của Phytophthora. Trong số các vi khuẩn đối kháng, IBFCBF-1 có hoạt tính khánh nấm cao nhất và được định danh dựa vào phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA, thử nghiệm sinh lý và sinh hóa và đặc điểm hình thái với tên khoa học là Bacillus amyloliquefaciens. Chủng IBFCBF-1 có hiệu quả kiểm soát tốt đối với P. capsici trong điều kiện nhà lưới. Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh trong ba nghiệm thức (CK 1 – xử lý với Phytophthora và nước cất, CK 2 – xử lý với Phytophthora và môi trường, T – xử lý với Phytophthora và chủng IBFCBF-1) lần lượt đạt 61,11, 52,78 và 13,89%. Hơn nữa, nghiệm thức xử lý với chủng IBFCBF-1 làm tăng đáng kể chiều cao cây, đường kính thân, trọng lượng khô của cây và trọng lượng khô của rễ. So với đối chứng, chiều cao cây tăng 17,3%, đường kính thân tăng 8,7%, trọng lượng khô phần trên tăng 38,8% và trọng lượng khô của rễ tăng 53,8% [109].

Chủng vi khuẩn vùng rễ Bacillus subtilis CAS15 có khả năng kháng nấm Fusarium và kích thích sinh trưởng trên cây hồ tiêu. CAS15 làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh héo do Fusarium từ 12,5% - 56,9% thông qua cơ chế gây kích kháng hệ thống. Khi xử lý vi khuẩn B. subtilis CAS15 trong điều kiện vườn ươm nhận thấy có sự khác biệt đáng kể về chiều cao cây vào thời điểm14, 21, 28 và 40 ngày, chiều cao cây tăng từ 27,24 - 54,53% so với đối chứng. B. subtilis CAS15 cũng tăng năng suất hạt hồ tiêu bằng cách rút ngắn thời gian ra hoa 50% xuống còn 17,26 ngày, tăng trọng lượng quả trung bình 36,92% và tăng năng suất trung bình mỗi cây 49,68%. Nghiên cứu cho thấy, B. subtilis CAS15 có tiềm năng lớn trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và kiểm soát sinh học [110]. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn vùng rễ khác thuộc chi

Bacillus bao gồm Bacillus amyloliquefaciens (WW6), Bacillus atrophaeus (MPB), Bacillus subtilis (CBF) và Bacillus vallismortis (WW14) còn có khả năng kháng lại nhiều loại nấm bệnh trên cây hồ tiêu bằng nhiều cơ chế khác nhau. Trong đó, hoạt tính kháng nấm Fusarium solani của chủng WW6, MPB, CBF và WW14 lần lượt đạt 43%, 45,7 %, 44% và 36,4%. Các chủng vi khuẩn này có khả năng tiết enzyme protease và cellulase thủy phân thành tế bào nấm cũng như các hợp chất dễ bay hơi hoặc khuếch tán [24].

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 224 trang tài liệu này.

Senthilkumar và Ananthan (2018) sử dụng các chủng vi sinh vật Pseudomonas fluorescens (Pfbv 22), Bacillus subtilis (Bbv 57), Trichoderma viridi, Biodynamic compost và nấm AM nhằm kiểm soát tuyến trùng sần rễ trên cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới [26]. Nghiên cứu chỉ ra rằng, tất cả các chủng vi sinh vật đều có khả năng làm tăng số lá và sinh khối cây hồ tiêu. Chủng P. fluorescens (Pfbv 22) có số lá cao nhất, tăng 40% so với đối chứng, tiếp theo là B. subtilis (Bbv 57), phân hữu cơ sinh học, nấm AM số lá tăng 25%. Trong khi đó, Trichoderma viridi và carbofuran có số lá thấp nhất đạt 3 lá. P. fluorescens (Pfbv 22), Biodynamic và nấm AM làm tăng sinh khối thực vật lên 50%, B. subtilis (Bbv 57) và nấm AM tăng 37,5%. Trong số các chủng được sử dụng, vi khuẩn P. fluorescens có khả năng làm giảm quần thể tuyến trùng trong đất, khối lượng trứng/g và tuyến trùng cái trưởng thành/g lần lượt đạt 60,1, 41,2 và 38,1% so với đối chứng [26].

1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Gần đây, do tình hình dịch bệnh gây hại nghiêm trọng trên nhiều vườn hồ tiêu với diện tích lớn, một số nghiên cứu được tiến hành như nghiên cứu xác định các đối tượng gây hại, nghiên cứu canh tác bền vững và tình hình sử dụng các giống hồ tiêu hiện nay ở Việt Nam.

Trên cây hồ tiêu, hai loại bệnh nguy hiểm nhất là bệnh chết nhanh do Phytophthora spp. gây ra hay còn gọi là bệnh héo chết nhanh và bệnh do tuyến trùng kết hợp với nấm gây hại hay còn gọi là bệnh vàng lá chết chậm hoặc bệnh héo chết chậm. Đề tài “Nghiên cứu các giải pháp quản lý tổng hợp dịch hại phát sinh từ đất trên cây hồ tiêu” do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam thực hiện đã khẳng định dịch hại trên cây hồ tiêu có nguồn gốc từ đất, chủ yếu là bệnh chết nhanh do Phytophthora spp., bệnh chết chậm do nấm Fusarium spp., Pythium spp., tuyến trùng và rệp sáp và là nguyên nhân chính dẫn đến sự không bền vững trong sản xuất hồ tiêu ở nước ta, làm giảm năng suất cây hồ tiêu, giảm tuổi thọ vườn tiêu và thu nhập

của nông dân trồng tiêu [28] . Hiện nay có 5 loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne được tìm thấy ở Việt Nam bao gồm M. incognita, M. javanica, M. graminicola, M. cynariensis và M. arenaria [67].

Nhằm tìm kiếm một số biện pháp giúp khắc phục các bệnh hại cho hồ tiêu, Trần Thị Thu Hà bước đầu có nghiên cứu về tính đa dạng của vi khuẩn vùng rễ Pseudomonas trên cây hồ tiêu [111]. Bên cạnh đó nhóm tác giả cũng nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tính chất của nấm Fusarium, Phytophthora capsici và thành phần tuyến trùng gây bệnh vàng lá trên cây hồ tiêu ở Cam Lộ, Quảng Trị [2], [3].

Với mong muốn giải quyết những khó khăn trong sản xuất cây hồ tiêu và nâng cao hiệu quả sản xuất và thu nhập cho người dân nghèo tỉnh Quảng Trị, Phạm Ngọc Dung (2011) đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng các biện pháp khoa học công nghệ quản lý tổng hợp bệnh hại chủ yếu trên cây hồ tiêu [112]. Nghiên cứu xác định được tác nhân chính gây bệnh vàng lá chết chậm là do tuyến trùng Meleidogyne incognita và bệnh chết nhanh do Phytophthora sp. Để hạn chế được sự lây lan của các tác nhân này, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm các biện pháp phòng trừ bằng kỹ thuật canh tác, bằng các chế phẩm sinh học (Trichoderma và SH1) hạn chế bệnh chết nhanh, chết chậm và các thuốc hóa học như Nokap 25EC và Oncol 20ND phòng trừ tuyến trùng trong đất, VibenC 50BTN 0,2% phòng trừ nấm Fusarium sp., Agrifos 400, Aliette 80WP và Ridomil gold 68 phòng trừ bệnh chết nhanh [112].

Đỗ Trung Bình nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật tổng hợp trong sản xuất cây hồ tiêu theo hướng bền vững, đề tài trọng điểm cấp Bộ, 2009-2012. Các nghiên cứu sử dụng phân hữu cơ (10 tấn); phân hữu cơ vi sinh humix (3tấn/ha) chứa các vi sinh hữu ích như Trichoderma, vi khuẩn cố định N tự do để bón cho vườn hồ tiêu kinh doanh. Bắt đầu có một số nghiên cứu sử dụng vi nấm đối kháng Trichoderma và phân bón hữu cơ đến tình hình bệnh vàng lá chết chậm cây hồ tiêu [113]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ tập trung ở khu vực nhỏ hẹp của Cam Lộ, Quảng Trị [112],

[114] tiến hành nghiên cứu về thành phần, mức độ gây hại của bệnh vàng lá chết chậm trên cây hồ hiêu ở Cam Lộ, Quảng Trị. Các tác giả xác định các đối tượng gây hại chính bao gồm Phytophthora spp., Fusarium spp., Pythium spp. và tuyến trùng.

Chế phẩm vi sinh vật SH-BV1 gồm 6 loại vi sinh vật A. beijerinckii, B. gisengihumi, S. owasiensis, B. subtiliss, T. haianum và M. anisopliae và thảo mộc được thử nghiệm trên cây hồ tiêu và cà phê tại Đắk Nông và Gia Lai. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng hại rễ hồ tiêu tại Gia Lai đạt 59,60 – 82,98%. Hiệu lực phòng trừ tuyến

trùng hại rễ cà phê tại tỉnh Đăk Nông đạt 61,77% - 79,32% [109].

Đỗ Thị Kiều An và cộng sự (2017) đã phân lập được các chủng nấm từ đất và rễ cây hồ tiêu tại vườn trồng hồ tiêu ở Đắk Nông có biểu hiện vàng lá, sinh trưởng chậm, rễ có u sưng nhằm sàng lọc khả năng đối kháng của chúng đối với tuyến trùng Meloidogyne incognita [116]. Trong số 21 chủng nấm thử nghiệm, 66,7% chủng có khả năng ký sinh tuyến trùng (trong đó: 23,8% kí sinh mạnh, 14,3% kí sinh trung bình và 28,6% kí sinh yếu). Bốn chủng nấm Trichoderma C07, C22, DY16 và T7 có khả năng ký sinh cao lên trứng tuyến trùng Meloidogyne incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm được tuyển chọn để nhân nuôi tạo chế phẩm và thử nghiệm khả năng đối kháng của chúng đối với tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại cây hồ tiêu con trong điều kiện nhà lưới. Bốn chủng nấm Trichoderma tuyển chọn đều có khả năng hạn chế mật số tuyến trùng Meloidogyne incognita trong rễ và đất trồng hồ tiêu, do đó làm cho chiều cao cây, số lá/cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và khô của cây cũng như bộ rễ đều tăng so với các nghiệm thức đối chứng không chủng nhiễm tuyến trùng và nghiệm thức chỉ chủng nhiễm tuyến trùng nhưng không xử lý chế phẩm nấm Trichoderma [116].

Một số chủng vi khuẩn vùng rễ đã được Nguyễn Thị Hương Cẩm và cộng sự (2018) tiến hành đánh giá khả năng đối kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại trên cây hồ tiêu giống Vĩnh Linh trong giai đoạn nhân giống vườn ươm [117]. Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức (5 chủng vi khuẩn vùng rễ và 2 nghiệm thức đối chứng) với 3 lần lặp lại được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên tại nhà lưới của Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên. Kết quả ghi nhận, cả 5 chủng vi khuẩn nghiên cứu đã làm giảm mật độ tuyến trùng M. incognita gây hại hồ tiêu với hiệu lực phòng trừ khá cao. Sau 3 tháng bổ sung vi khuẩn đợt 2, mật độ tuyến trùng M. incognita trong đất giảm 49,76 - 99,84% và giảm 30,47 - 99,93% so với nghiệm thức đối chứng. Tỷ lệ u sung ở rễ, tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh vàng lá chết chậm trên cây hồ tiêu giai đoạn vườm ươm ở những nghiệm thức chủng vi khuẩn đã giảm rõ rệt: tỷ lệ u sung ở rễ giảm đến 100%; tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh vàng lá chết chậm lần lượt giảm đến 51,32% và 65,56% so với đối chứng. Kết quả cho thấy, 2 chủng Bacillus safensis KN20 và Paenibacillus polymyxa có tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh tuyến trùng M. incognita gây hại rễ hồ tiêu [117].

Nguyễn Văn Bốn và cộng sự (2019) đã tuyển chọn được E7 và E13 từ 17 chủng phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita với giá trị gây chết tuyến trùng lần lượt đạt 83,33% và 90%. Hai chủng này được định danh với tên khoa học là Bacillus megaterium E7 và Bacillus cereus E13 bằng phương pháp MALDI Biotype [118].

Tóm lại hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng cũng như hoạt tính kháng Phytophthora, Fusarium và tuyến trùng Meloidogyne đang còn ít được quan tâm và chưa tiến hành một cách hệ thống trên cây hồ tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì thế nghiên cứu được tiến hành nhằm giải quyết vấn đề này.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

+ Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại ba tỉnh chuyên canh hồ tiêu ở Tây Nguyên bao gồm Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.

+ Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu.

+ Nấm bệnh Phytophthora capsici đã được phân lập từ rễ cây hồ tiêu Vĩnh Linh bị nhiễm bệnh chết nhanh, được định danh và và bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ - 80 oC tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường (CNSH&MT), trường Đại học Tây Nguyên.

+ Nấm bệnh Fusarium oxysporum đã được phân lập từ rễ cây hồ tiêu Vĩnh Linh bị nhiễm bệnh chết chậm, được định danh và bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ

- 80oC tại Viện CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên.

+ Tuyến trùng Meloidogyne sp. được thu nhận trực tiếp từ rễ cây hồ tiêu bị u sưng (Khi thu nhận sử dụng kéo sạch và cắt sát, không để vết thương hở tiếp xúc với đất), đựng trong túi nilon sạch. Rửa sạch rễ đã thu nhận, dùng dao lam hoặc dao rọc giấy, cắt phần vỏ, thu các bọc trứng để vào đĩa petri chứa nước cất vô trùng, đậy nắp đĩa petri, để tối, ủ ở nhiệt độ phòng từ 24 giờ đến 48 giờ. Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi và xác định mật độ tuyến trùng.

+ Một số hóa hóa chất và môi trường dùng trong nghiên cứu:

LB: Trypton: 10g, Cao nấm men: 5g, NaCl: 5g, Nước cất đủ 1 lít; PGA: Khoai tây (potato): 200g, D- Glucose: 20g, Agar: 20g, pH 5.6, Nước cất đủ 1 lít.

LB-chitin 1%: Trypton: 2g; Cao nấm men: 1g; NaCl: 5g, Huyền phù chitin (50ml), nước cất đủ 1 lít; LB-casein 1%: Trypton: 2g, Cao nấm men: 1g, NaCl: 5g, Casein 1%, nước cất đủ 1 lít, LB- β-glucanase 0,1%: β-glucan (0,035g), MgSO4..7H2O (0,07g), KNO3 (0,2625g), K2HPO4 (0,175g), FeSO4..7H2O (0,007g),

CaCl2 (0,014g), cao nấm men (0,7g), glucose (0,35g), nước cất đủ 1 lít.

TSB: Trypticase peptone: 17g, Phytone peptone: 3g, K2HPO4 5g, NaCl: 5g, Glucose: 0,25g, nước cất đủ 1 lít, pH 7; NB: Tryptone 10g, meat extract 5g, NaCl 5g; PEP: Pepton 10g, Meat extract 7g, NaCl 5g, nước cất đủ 1 lít, pH 7; Pepton (1): pepton 17g, cao thịt 7g, NaCl 5g, nước cất đủ 1 lít; Pepton (2): pepton 12g, cao thịt 10g, NaCl 5g, nước cất đủ 1 lít; Pepton (3): pepton 20g, cao thịt 5g, NaCl 5g; Pepton (4): pepton 7g, cao thịt 12g, NaCl 5g, nước cất đủ 1 lít.

Sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn và xác định hoạt tính theo thời gian bảo quản sản phẩm (1-6 tháng)

SƠ ĐỒ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

Thu thập và phân lập các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện in vitro

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu trong điều kiện vườn ươm

Định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium, kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ ở cây hồ tiêu

Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn tuyển chọn (môi trường, pH, thời gian, nhiệt độ, tốc độ lắc)

Xác định đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium của chủng vi khuẩn tuyển chọn

Xác định đặc tính kháng tuyến trùng của chủng vi khuẩn tuyển chọn

Phân tách, xác định cấu trúc và hoạt tính kháng tuyến trùng, kháng nấm của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi khuẩn tuyển chọn