Đối Tượng, Nội Dung Và Phương Pháp Nghiên Cứu‌

thành các tổ hợp tác, hợp tác xã sản xuất thủy, hải sản trên địa bàn tỉnh. Để có được những kết quả trên, tỉnh đã chỉ đạo quyết liệt, hỗ trợ kinh phí để các địa phương khảo sát, lập và hoàn thành các quy hoạch nông nghiệp, nông thôn đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030 ở cấp tỉnh, cấp xã, trong đó có quy hoạch phát triển thủy sản tập trung. Việc dồn điền, đổi thửa, tích tụ ruộng đất để phát triển các vùng nuôi thủy sản tập trung được tỉnh, các huyện quan tâm, khuyến khích tạo điều kiện thuận lợi. Tôm thẻ chân trắng được coi là có giá trị kinh tế cao, được người dân lựa chọn để phát triển nhanh thành các vùng nuôi tập trung theo phương thức thâm canh, siêu thâm canh và ứng dụng công nghệ cao tạo sản lượng thủy sản hàng hóa với quy mô lớn để hình thành chuỗi liên kết giá trị từ sản xuất đến tiêu dùng gắn với quản lý và truy xuất nguồn gốc kết hợp xây dựng thương hiệu sản phẩm. Bên cạnh các thuỷ sản nuôi trồng truyền thống, những năm qua tỉnh đặc biệt coi trọng phát triển một vài loại đặc sản trong đó có tôm thẻ chân trắng.

Thời gian tới Chi cục Thủy sản tỉnh Nam Định tăng cường khảo sát và tuyên truyền đến các hộ nuôi trồng thủy sản trên địa bàn tỉnh căn cứ vào điều kiện thực tiễn để áp dụng những thành tựu khoa học công nghệ vào sản xuất. Phối hợp với các ngành chức năng, các đơn vị có liên quan khuyến khích các nhà khoa học nghiên cứu các ứng dụng mới, các biện pháp cải tiến kỹ thuật giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm thủy, hải sản, tạo sức bật mới trong chăn nuôi thủy sản của tỉnh.

1.6. Cơ sở thực tiễn

Hiện nay đã có nhiều các công trình nghiên cứu về bacteriocin đã được báo cáo trong các tài liệu tham khảo, tuy nhiên trình tự các amino acide đối với hầu hết các bacteriocin còn chưa được xác định. Trong số các loại vi sinh vật được coi là an toàn (GRAS), nhóm vi khuẩn lactic acid bacteria (LAB) và Bacillus thường được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và chăn nuôi.

Phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam có đầy đủ các máy móc, thiết bị, dụng cụ đảm bảo cho các nghiên cứu của đề tài được thực hiện. Các chuyên gia hàng đầu về nghiên cứu

khoa học có thế mạnh trong kỹ thuật phân lập và tuyển chọn vi sinh vật, đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học ngoại bào của vi sinh vật, định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tạo chế phẩm sinh học.

Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định có nhiệm vụ tìm ra vi sinh vật bản địa từ quá trình chăn nuôi tôm, có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin làm tiền đề cho việc tạo ra chế phẩm phù hợp với các điều kiện tự nhiên của địa phương để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 81 trang tài liệu này.

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

Mục tiêu chung:

Tuyển chọn được 1-2 chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định.

Mục tiêu cụ thể:

- Tuyển chọn được 1-2 chủng probiotic sinh bacteriocin

- Định danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Xây dựng được phương pháp thu nhận bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm.

CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU‌

3.1. Đối tượng nghiên cứu

3.1.1. Vật liệu

- Các mẫu ruột tôm được thu thập từ vùng biển huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định được sử dụng để phân lập các chủng vi khuẩn của đề tài.

- Các chủng vi sinh vật kiểm định được lấy từ bộ sưu tập các chủng của Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm E. coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923; Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi.

3.1.2. Dụng cụ máy móc, thiết bị, hoá chất

- Kính hiển vi Nikon YS100, máy ly tâm Hittich MIKRO 185, tủ nuôi lắc Wise Cube, nồi khử trùng Tomy ES 315, bốc cấy, cân điện tử, tủ ủ, buồng đếm hồng cầu và một số dụng cụ khác.

- pH kế

- Tỷ trọng kế, tủ sấy, bình hút ẩm

- Ống đong, cốc đong, pipet, que cấy, đầu côn, ống ly tâm, ống falcon, duran, đĩa petri, bình tam giác các loại.

- NaOH, HCl, …

3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường phân lập:

Môi trường Luria-Bertani (LB-agar): peptone 10 g, cao nấm men 5 g, NaCl 5 g, agar 20g, pH 7, nước cất vừa đủ 1 lít.

Nutrient Broth (NB-agar): peptone 10 g, cao thịt bò 5 g, NaCl 5 g, agar 20g, pH 7, nước cất vừa đủ 1 lít.

- Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được khử trùng ở 121°C trong 20 phút, để nguội trước khi sử dụng.

- Hoá chất: Kit E.Z.N.A. ® Bacterial của hãng OMEGA, Master Mix (Invitrogen, Mỹ).

- Môi trường LB với các thành phần như trên có bổ sung các cơ chất tinh bột (0,2%, w/v), Carboxymethyl cellulose (CMC) (0,2%, w/v) và casein (0,2%, w/v), được sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính của các enzyme ngoại bào tương ứng amylase, celluase, protease bằng phương pháp khuếch tán.

3.2. Nội dung nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định.

Nội dung 2: Định danh đến loài chủng vi sinh vật được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

Nội dung 3: Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.

Nội dung 4: Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm.

3.3. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

3.3.1. Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật

- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu tôm: Tiến hành mổ tách lấy ruột của tôm nước mặn. Mẫu ruột tôm được cho vào ống eppendoft có chứa nước muối sinh lí. Mẫu được pha loãng đến nồng độ 10-4, hút 100 µl dịch đã pha loãng cấy trải trên môi trường LB-agar và bọc kín, ủ ở 37ᵒC. Sau 2 ngày quan sát các khuẩn lạc, cấy chuyển để tách các dòng vi khuẩn thuần. Chọn khuẩn lạc đặc trưng và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria trên môi trường LB-agar cho tới khi quan sát thấy chỉ có một dạng khuẩn lạc duy nhất trên môi trường. Khi các khuẩn lạc đã thuần sau nhiều lần cấy chuyển sàng lọc, tiến hành giữ giống và bảo quản ở -20oC trong glycerol 30%. Các khuẩn lạc riêng rẽ được nhặt ra để kiểm tra một số hoạt tính kháng khuẩn và sinh tổng hợp enzyme theo các sơ đồ thể hiện trên hình 3.1 và 3.2.

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn thu được từ ruột tôm

Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật phân lập

- Phương pháp xác định số lượng tế bào:

Số lượng vi khuẩn tổng số được xác định bằng phương pháp cấy trải trên đĩa thạch: 1 g mẫu được pha loãng từ 10-1 đến 10-7, hút 100µl dung dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ (10-4- 10-7) cấy trang trên đĩa môi trường LB, ủ ở 37oC, sau 48h, đếm khuẩn lạc trên các đĩa và xác định số CFU/g (i);

- Số lượng khuẩn lạc (cfu/g) của Bacillus được xác định theo phương pháp như mô tả ở (i) sau khi đã định danh đến loài chủng chọn lọc thuộc chi Bacillius bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

- Phương pháp thử hoạt tính enzyme ngoại bào (protease, xenlulase, amylase)

Phương pháp này được thực hiện theo cách nuôi cấy trên môi trường sinh enzyme và khuyếch tán dịch nuôi trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng 0,2% cazein, 0,1% CMC hoặc 0,2% tinh bột tan). Lên men trên môi trường cơ bản LB, nuôi lắc 200 rpm ở 37oC trong 36-48 giờ, thu dịch lên men để xác định hoạt tính kháng khuẩn và khả năng thủy phân cơ chất bột, cellulose và casein.

Hoạt tính enzyme được kiểm tra bằng phương pháp đục lỗ thạch trên nền môi trường LB có chứa cơ chất cho từng loại enzyme amylase, cellulase và protease lần lượt là tinh bột, CMC và casein. Dịch nuôi vi khuẩn (100 µl) được cho vào giếng đúc trên đĩa thạch, ủ qua đêm ở 37oC, nhuộm màu bề mặt đĩa petri và đo kích thước đường kính vòng thủy phân cơ chất (∆=D-d) (mm), trong đó D là đường kích vòng thủy phân, d là đường kính giếng đúc trên đĩa thạch (6 mm),

∆ hoạt tính phân giải cơ chất thực.

- Amylase: Môi trường xác định hoạt tính amylase là tinh bột tan, agar 2%, ủ ở 37°C qua đêm. Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Iodide 1% và đo đường kính vòng thủy phân.

- Cellulase: Môi trường xác định hoạt tính cellulase là CMC, agar 2%, ủ ở 37°C qua đêm. Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân.

- Protease: Môi trường xác định hoạt tính protease là casein, agar 2%, ủ ở 37°C qua đêm. Sau đó nhuộm màu bằng TCA 25% và đo đường kính vòng thủy phân.

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch:

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản như E.coli, S.aureus, V.harveyi, V.paraheamolyticus, Salmonella typhi của vi khuẩn tuyển chọn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các vi khuẩn gây bệnh được nuôi trong môi trường LB lỏng 24h /37oC. Sau đó tiến hành hút và cấy trang vi khuẩn kiểm định trên môi trường LB chứa 3,5% NaCl. Để khô tự nhiên và tiến hành khoan lỗ thạch, kích thước lỗ thạch (d=6mm).

Nhỏ 30 𝜇𝑙 dịch nổi nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào (sau ly tâm) vào mỗi giếng. Sau khi nhỏ dịch để khô tự nhiên. Để đĩa thạch vào tủ nuôi 37oC trong 24h. Căn cứ vào việc xuất hiện vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh để xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh. Hoạt tính được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm). Trong đó: D là đường kính vòng kháng khuẩn (mm), d là đường kính lỗ thạch. Đối chứng dương (PC) là giếng có bổ sung 30 𝜇𝑙 0,1g/L Streptomycin, đối chứng âm (NC) là giếng có chứa 30 𝜇𝑙 NaCI 0,9%.

Vi sinh vật kiểm định: Các chủng vi khuẩn kiểm định bao gồm E.coli, S.aureus, V.harveyi, V.paraheamolyticus, Salmonella typhimurium với mật độ 107 CFU/ml của Phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 3.3. Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi sinh vật phân lập