dạng chất thải hữu cơ là nguồn ô nhiễm cho ao nuôi. Ruột tôm rất ngắn, hệ cơ quan nội tạng rất đơn giản, hoạt động của hệ tiêu hoá, gan tuỵ và hệ thống các enzymes đường ruột rất yếu kém. Lượng thức ăn vào hệ thống tiêu hoá là quá tải đối với hệ tiêu hoá tôm, tạo sức ép, gánh nặng lên hoạt động tiêu hoá, gan tuỵ, (tôm dễ mắc bệnh gan tuỵ). Ngoài việc lãng phí thức ăn làm tăng chi phí cao, tôm rất nhạy cảm với các điều kiện bất lợi và sức khoẻ tôm dễ bị ảnh hưởng. Lượng thải ra môi trường ao nuôi trong ngày là rất lớn gây ô nhiễm, đặc biệt trong điều kiện nuôi tôm với mật độ dày đặc.
Trong khoảng thời gian gần đây nghề nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt gây ra thiệt hại lớn về kinh tế. Đáng quan tâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính [19] hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) [28]. Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 [28], [19]. Bệnh này xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre và Kiên Giang. Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng. Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn (Bateriophage) [29]. Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học,.... Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất, kháng sinh dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh. Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trong thực phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nông nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi probiotic có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh mà còn đảm
bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng các loài vi khuẩn hữu ích [3]
Với tác dụng kháng khuẩn, tiêu diệt được nhiều vi khuẩn có hại, bacteriocin giúp tôm khoẻ, hạn chế được lượng kháng sinh dùng trong chăn nuôi tôm, góp phần cho bảo vệ môi trường và tạo ra nguồn thực phẩm là tôm an toàn, không bị dư lượng kháng sinh, đảm bảo sức khoẻ người tiêu dùng và tăng tỷ lệ thành công trong nuôi tôm cao sản bằng công nghệ cao. Bacteriocin phát triển ngành nuôi tôm, giúp xuất khẩu tôm sạch ra thế giới, mang lại ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào sản xuất và chế biến thực phẩm.
Việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) còn giúp đối động vật hấp thụ thức ăn dễ hơn giảm hệ số tiêu thụ thức ăn tăng năng suất 20 – 30% [40]. Probiotic được dùng cho NTTS có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe vật chủ
[41] như loại trừ cạnh tranh [10] bổ sung enzyme vào quá trình tiêu hóa [11]và tăng cường phản ứng miễn dịch.
Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây, nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản [2],[8]. Các vi sinh vật có lợi làm giảm ô nhiễm nguồn nước, bổ sung vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho thủy sản [12]. Trong môi trường nước nuôi tôm và cá chứa các loại hợp chất hữu cơ thường chứa hàm lượng cao: protein, cacbonhidrate, kitin,… Sự phân hủy protein bởi nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và Enterobacteriaceae trong nước nuôi [6]. Nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrate bao gồm các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nó còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas ở cá [47]. Do đó, phân lập và chọn lựa được chủng vsv tiềm năng sinh tổng hợp bacteriocin, có tính chất probiotic định hướng dùng trong NTTS là rất cần thiết.
Có thể bạn quan tâm!
-
Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm - 1 -
Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm - 2 -
Đối Tượng, Nội Dung Và Phương Pháp Nghiên Cứu -
Định Danh Chủng Vi Sinh Vật Có Khả Năng Sinh Tổng Hợp Bacteriocin Đã Được Tuyển Chọn -
Khả Năng Sinh Tổng Hợp Enzyme Amylase, Cellulase Và Protease
Xem toàn bộ 81 trang tài liệu này.
1.4. Tổng quan các công trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin trong và ngoài nước
Các vi sinh vật như Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học. Chúng không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng. Chúng có khả năng phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ các enzyme do chúng tạo ra. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn như bacteriocin được dùng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn của động vật nuôi, làm giảm sự sinh sôi và phát triển của những vi sinh vật có hại. Nhờ những đặc điểm này mà chúng được sử dụng để cải thiện môi trường nước, nâng cao hiệu quả kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm.
Nhóm vi khuẩn Bacillus tiềm năng sản sinh bacteriocin, sinh enzyme ngoại bào. Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh thái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với khoảng gần 500 loài và dưới loài. Các hoạt chất sinh học của chúng cũng vô cùng phong phú: các enzyme ngoại bào, các chất kháng khuẩn, bacteriocin và kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất hoạt động bề mặt [5].
Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng tạo nội bào tử khi gặp điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ, hóa chất… Bào tử có thể tồn tại trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng. Bacillus là những vi khuẩn hóa tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ như các loại đường, axit amin, các axit hữu cơ. Một số ít loài như B. megaterium lại không cần đến các yếu tố sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B hoặc các axit amin. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm, tối ưu 30 – 45oC, một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC. Một số loài ưa lạnh có thể sinh
trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng từ 2-11. Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH 7 như B. alcalophillus, hay pH 2 - 6 như B. acidocaldrius [5].
Hầu hết các Bacillus là không độc hại cho người (ngoài B. anthracis gây bệnh than cho người). Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy chất hữu cơ có nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải từ tôm cá: protease phân hủy protein, amylase phân hủy tinh bột, xenlulase phân hủy xenlulose, kitinase phân giải kitin. Ngoài chức năng phân giải các hợp chất hữu cơ làm sạch môi trường thì Bacillus còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học.
Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, enzymes, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy chất hữu cơ là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và cải thiện chất lượng nước [5].
Bacteriocin được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis được xác định là một loại thuốc mới chống lại các vi khuẩn gây bệnh loét chân do tiểu đường (Baby, J., 2013). Một số chủng Bacillus subtilis cũng được coi là vi khuẩn probiotic, tồn tại trong sinh phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi vào dạ dày nó không bị axit cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột, bào tử nảy mầm và phát triển thành thể hoạt động. Giai đoạn này, B. subtilis tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể như các enzym thủy phân, các vitamin, axit amin …Một số enzyme như protease, α-amylase, β-glucanase và một số enzyme khác hoạt động mạnh có lợi cho tiêu hóa ở ruột. Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 30 – 50oC. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4. Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích
thước từ 0,8 – 1,8µm. Bacillus subtilis cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng để phát triển; quan trọng nhất là carbon và nitơ; có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon. B. subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo ra hai tế bào con (phân hạch nhị phân) hoặc không đối xứng, tạo ra một endospore duy nhất có thể tồn tại trong nhiều thập kỷ và chịu được các điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán , nhiễm mặn, pH cao, bức xạ và dung môi . Các endospore được hình thành tại thời điểm căng thẳng dinh dưỡng cho phép vi sinh vật tồn tại trong môi trường cho đến khi điều kiện trở nên thuận lợi.
Nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH môi trường…. Khoảng nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35 – 37oC. Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường rắn thì pH môi trường gần như không có sự thay đổi nhiều nên sự ảnh hưởng của pH cũng không lớn tới vi khuẩn B. subtilis. Nhưng ngược lại nếu nuôi chìm, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới vi khuẩn B. subtilis. pH môi trường thích hợp nhất để vi khuẩn B. subtilis sinh trưởng là 6,8 – 7,5.
Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic. Các vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau, được chia thành hai loại hình cầu và hình que.
Vi khuẩn lactic (LAB) bao gồm một số chi: Carnobacterim, Enterococcus, Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute.
Streptococcus có tế bào hình cầu hoặc hình ovan, đường kính khoảng 0,5 - 1,0 µm, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài lớn hơn chiều rộng, như Streptococus lactic [7].
Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 - 0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài 1- 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [7].
Lactobacillus có hình que, là loại vi khuẩn phổ biến nhất, hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu cho đến hình que dài, chẳng hạn như L. plantatum.
Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ sinh tổng hợp chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin và một số acid hữu cơ khác. Chúng làm giảm mùi hôi của ao nuôi thủy sản. Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm thủy sản. Khi sử dụng nhóm vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài mục đích làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [4].
Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định được bản chất của bacteriocin đồng thời xác định được một số loại bacteriocin do LAB sinh ra và khả năng ứng dụng của nó. Những công trình này đã có những đóng góp tích cực, nâng cao chất lượng cuộc sống con người. Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm dến việc sử dụng bacteriocin do LAB tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thế các loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao. Tuy nhiên để có thể thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa những chủng vi khuẩn có khả năng cao sinh tổng hợp bacteriocin tiến tới có thể tạo dựng bằng kỹ thuật sinh học và khẳng định những chủng mới thích hợp phục vụ cho sản xuất công nghiệp. Bacteriocin được A. Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925, kết quả của công trình này tác động mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn. Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại
bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào, được dùng nhiều trong bảo quản thức ăn, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi.
Bacteriocin được chia thành ba nhóm chính: lantibiotics, non-lantibiotics và những peptide lớn (KLPT> 30 kDa). L. plantarum NCDO 1193 tạo ra bacteriocin (plataricin B) hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dương [10]. Chủng L. sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin (plataricin sakacin) ức chế đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây thối [34]. Lactobacillus phân lập từ thịt lên men tự nhiên có một số thuộc tính probiotics, Lactobacilli từ thực phẩm lên men truyền thống của Thái Lan, với khả năng sống sót cao ở điều kiện acid và muối, ức chế vi khuẩn gây bệnh, nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh. Lactobacilli có nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng bám vào tế bào; ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinh dưỡng; kích thích miễn nhiễm, tồn tại và tăng mật độ, tạo ra acid, H2O2 và bacteriocin, cân bằng vi sinh đường ruột [45]. Bacteriocin thô từ L. sake có khả năng ức chế
L. monocytogenes. Bacteriocin từ L. fermentum và L. acidophilus được phân lập từ yogurt, phân gà ... ức chế E.coli kháng lại kháng sinh cephalosporin [36].
Loài Streptococcus sinh ra bacteriocin ở dạng nisin, có tính kháng sinh.
Leconostoc mesenteroides tạo ra bacteriocin (mesenterocin 5) chống lại vi khuẩn
L. monocytogenes gây ngộ độc trên thực phẩm. Pediococcus pentosaceus FBB61 tạo ra bacteriocin (Pedicin A) ức chế Lactobacillus, Listeria và Clostridium. Bifidobacterium infantis BCRC 14602 tạo ra bacteriocin (Bifidin I) ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây thối.
Bacteriocin hay những chất giống bacteriocin từ LAB mà đặc biệt là chi Lactobacillus có khả năng ức chế lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh đã được nghiên cứu và công bố bởi nhiều tác giả. Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tạo ra bacteriocin. Todorov và Dicks nghiên cứu bacteriocin ST712BZ – một bacteriocin được tạo ra bởi Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ Boza (một thức
uống truyền thống của Bulgaria được tạo ra từ sự lên men của nhiều loại ngũ cốc). Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin ST712BZ ức chế được nhiều loài vi khuẩn như Lactobacillus casei, Escherichia coli,... bên cạnh đó thì việc thay đổi khối lượng của một số thành phần môi trường nuôi có ảnh hưởng tới hoạt tính của bacteriocin này [42]. Karthikeyan và Santosh đã phân lập và mô tả một loại bacteriocin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum, loài vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon), bacteriocin này đã kháng lại được một vài vi khuẩn gây bệnh như Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus,.. [25].
1.5. Tình hình nuôi tôm tại tỉnh Nam định
Thời tiết diễn biến phức tạp cùng với môi trường bị ô nhiễm, luôn tiềm ẩn nguy cơ bùng phát dịch bệnh đã làm ảnh hưởng trực tiếp đến nghề nuôi tôm ở các địa phương trong tỉnh Nam Định. Thời gian qua, nhiều hộ nuôi tôm đã mạnh dạn đầu tư cơ sở hạ tầng, cải tiến quy trình kỹ thuật, đưa những mô hình mới vào sản xuất nhằm tăng năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế. Chi cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã cấp giấy chứng nhận VietGAP cho hàng loạt trang trại nuôi tôm tại tỉnh Nam Định [1] Hiện nay, toàn tỉnh có 75 vùng nuôi trồng thủy sản tập trung với diện tích khoảng 7.000ha và có trên 6.000 hộ chăn nuôi ở cả khu vực nước mặn, lợ và nước ngọt. Phương thức nuôi chuyển từ nuôi quảng canh và quảng canh cải tiến sang nuôi thâm canh và siêu thâm canh, áp dụng theo quy trình VietGAP, nuôi công nghệ cao. Đối tượng con nuôi phát triển khá đa dạng và đang từng bước hình thành sản phẩm thủy đặc sản của địa phương. Các vùng nuôi tập trung áp dụng khoa học công nghệ cao ở khu vực nuôi tôm thẻ chân trắng. Các tiến bộ khoa học kỹ thuật đang được các hộ nuôi ứng dụng như công nghệ nuôi tôm 2, 3 giai đoạn, công nghệ biofloc, nuôi ít thay nước, nuôi tuần hoàn nước, ứng dụng công nghệ vi sinh thay cho các sản phẩm kháng sinh, hóa chất phục vụ nuôi thủy sản. Việc nuôi trồng thủy sản theo hướng tập trung ứng dụng khoa học công nghệ không chỉ đẩy mạnh sản lượng cũng như chất lượng sản phẩm thủy hải sản mà còn là tiền đề hình