Trang chủ / Tôm Nước Mặn

Định Danh Chủng Vi Sinh Vật Có Khả Năng Sinh Tổng Hợp Bacteriocin Đã Được Tuyển Chọn


3.3.2. Định danh chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đã được tuyển chọn

Chủng giống: Chủng vi khuẩn N1.4 được phân lập và tuyển chọn, có hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định, có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được dùng cho nghiên cứu tiếp. Chủng N1.4 được lưu giữ tại Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Phương pháp hoạt hóa và lên men chủng

Chủng vi khuẩn N1.4: Chủng vi khuẩn N1.4 được hoạt hóa trên môi trường thạch LB, sau đó được nuôi ở 37°C trong 48 giờ, thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc được lên men lỏng trong bình tam giác 250ml có chứa 50 ml môi trường LB lỏng ở 37°C, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ, ly tâm thu tế bào và tiến hành tách chiết DNA.

- Phương pháp tách DNA tổng số của vi khuẩn

Tiến hành tách chiết ADN theo kit E.Z.N.A.® Bacterial của hãng OMEGA theo quy trình như sau:

+ Chủng N1.4 được nuôi cấy qua đêm ở 37oC trong môi trường LB. Hút 1,5 ml dịch nuôi cho vào ống Eppendorf.

+ Ly tâm 4000rpm/10 phút 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào.

+ Sinh khối tế bào được hoà trong 100l TE (15 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA).

+ Thêm vào 10µl lysozyme, trộn đều, ủ 370C trong 10 phút.

+ Thêm 100l BTL Buffer và 20µl Proteinase K, vortex đều, ủ 55oC/60 phút.

+ Thêm 5l ARNase, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm 10000rpm trong 2 phút, chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.

+ Thêm 220µl BDL Buffer, vortex đều, ủ 65oC trong 10 phút.

+ Thêm 220µl Etanol 100%, vortex trong 20 giây ở tốc độ lớn nhất.

+ Chèn cột vào ống 2ml, chuyển mẫu sang cột (cả tủa), ly tâm 10000rpm/1 phút.

+ Chuyển cột sang ống 2ml mới, thêm 500µl HBC Buffer, ly tâm 10000rpm/1 phút.


+ Bỏ phần lọc và sử dụng lại ống, thêm 700µl DNA wash buffer, ly tâm 10000rpm/1phút, lặp lại từ 1 đến 2 lần.

+ Bỏ dịch lọc và dùng lại ống, ly tâm với tốc độ tối đa trong 2 phút (làm khô cột).

+ Chuyển cột sang ống 1,5ml mới, thêm 50µl Elution buffer, để 3 đến 5 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 10000rpm/1 phút, thu dịch và bảo quản ở -20oC.

- Phương pháp chạy điện di DNA

+ Nguyên tắc: Vì nucleic acid là đại phân tử sinh học tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trường không đổi chúng sẽ di chuyển từ cực âm đến cực dương. Tốc độ chuyển động của chúng trong gel phụ thuộc vào kích thước, các phân tử DNA có kích thước lớn thì chạy chậm hơn các phân tử có kích thước nhỏ.

+ Quy trình: Điện di DNA trên gel agarose 1%. 1g agarose được cho vào 100 ml đệm TAE 1X và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50oC rồi đổ vào khay điện di có cài sẵn lược. Để gel đông ổn định khoảng 30 phút sau đó gỡ lược ra cho bản gel vào bể điện di chứa đệm TAE 1X sao cho TAE ngập bản gel và tra mẫu (5 µl mẫu được trộn với 1µl dye) vào giếng. Chạy điện di ở 110V, 40A trong khoảng 20 – 30 phút thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong EtBr trong 5 phút, rửa lại với nước. Kết quả các băng AND điện di được quan sát dưới đèn cực tím UV của máy soi gen.

- Phương pháp PCR

Khuếch đại gene 16S rRNA và đọc trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4. Để nhân đoạn gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn chọn lọc cặp mồi:

Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu


27F

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', gen đích vùng V1

(Song et

al. 2005)

1492R

5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3', gen đích vùng V9

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 81 trang tài liệu này.

Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm - 5

Hỗn hợp phản ứng PCR (25 µl) gồm các thành phần và chu trình nhiệt như sau:



Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR

Dung dịch

Thể tích (µl)

Master Mix

12,5

DNA khuôn (5ng/µl)

2

Primer F (10 ppm)

1

Primer R (10 ppm)

1

dH2O

8,5


Bảng 3.3. Chu trình phản ứng PCR

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Chu kì

94

5 phút


94

1 phút


55

25 giây

35

72

1 phút 30 giây


72

7 phút


25

∞


Sản phẩm PCR sau tinh sạch bằng bộ kít (GeneJET PCR purification kit của Thermos Scientific) và được gửi đến phòng Trung tâm giám định DNA- Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để xác định trình tự đoạn gen.

Phân tích cây phả hệ để xác định mối quan hệ di truyền của chủng chọn lọc

N.1.4 với các chủng vi khuẩn khác theo Sambrook & Russell [38].

3.3.3. Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh bacteriocin:


Môi trường lỏng của LB được bổ sung các muối: KCl, ZnSO4, MnSO4, CuSO4, MgCl2, CaCl2, NaNO3, NaHCO3, mỗi loại 1 mM được bổ sung vào môi trường riêng rẽ hoặc tổ hợp.

Môi trường sau khi được chuẩn bị được khử trùng ở 121°C trong 20 phút và để nguội trước khi sử dụng. Quá trình lên men được thực hiện tại các giá trị: tốc độ khuấy 180 vòng/phút; pH 7; nhiệt độ lên men 37oC; mật độ giống 107 CFU/ml; thời gian lên men 48 giờ.

Các vùng ức chế xung quanh giếng được kiểm tra để xác định hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin được biểu thị bằng đơn vị (AU: arbitrary units) trên mỗi ml.

Theo cách tính: (AU /ml = 2n *1000/V); trong đó (V thể tích mẫu µl cho vào giếng trên đĩa thạch); n là hệ số pha loãng lớn nhất vẫn cho hoạt tính ức chế.

- Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin

Các nghiên cứu được thực hiện tại những điều kiện lên men theo cách thay đổi yếu tố theo dòi và giữ nguyên các yếu tố còn lại (theo các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường lên men đã thực hiện):

+ Tốc độ khuấy (vòng/phút): 140, 150, …210, 220, bước nhảy 10 vòng/phút;

+ pH môi trường: 4-10, bước nhảy 1;

+ Nhiệt độ lên men (oC): 31, 33, … 45, bước nhảy 2oC;

+ Mật độ giống (CFU/ml): 106, 107, 108;

+ Thời gian lên men (giờ): 24, 48, 72, 96.

3.3.4. Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin qui mô phòng thí nghiệm.

Dung môi hữu cơ, etyl axetat, n-butanol, n-hexan, diclometan, triclometan, được trộn riêng rẽ với với phần dịch nổi lên men theo tỷ lệ như nhau (1/1), và lắc 200 vòng/phút trong trong 2 giờ. Pha chứa dung môi được tách, sau đó dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cô quay hút chân không để thu cặn ở 55oC. Phần cặn của dịch chiết dung môi được hoàn nguyên với 1/100 thể tích dung dịch PBS đến pH 7.


- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và protease đến hoạt tính của bacteriocin

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của bacteriocin, dịch nổi lên men chủng vi khuẩn được ủ tại các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 40 - 100°C (bước nhảy là 5oC), ủ trong 30 phút. Hoạt tính bacteriocin còn lại được xác định bởi phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

+ Ảnh hưởng của pH: Ảnh hưởng của pH lên bacteriocin được xác định bằng cách điều chỉnh giá trị pH của dịch nổi sau lên men của vi khuẩn bởi HCl và NaOH 1N từ 3 - 12 (bước nhảy là 1 đơn vị pH) và ủ trong 2 giờ ở 37°C. Tất cả các mẫu sau đó được điều chỉnh lại đạt giá trị pH ban đầu trước khi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn.

+ Ảnh hưởng của enzyme: dịch nổi sau lên men được xử lý trong 2 giờ với enzyme lysozyme, protease K, tripsin, Amylase tại nồng độ cuối là 1mg/ml. Hoạt tính bacteriocin còn lại kháng các chủng vi khuẩn kiểm định được phân tích bởi phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Dịch lên men không bị xử lý bởi enzyme được sử dụng như đối chứng.

3.3.5. Phương pháp đo OD để đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật

Nguуên lý đo mật độ quang (optical density - OD) : Dựa trên nguуên lý của hiện tượng quang phổ hấp thụ. Quang phổ hấp thụ thực chất là quá trình tương tác giữa hạt photon của ánh ѕáng ᴠới các phần ᴠật chất. Khi ta chiếu một chùm tia ѕáng gồm các photon có các mức năng lượng khác nhau đi qua một dung dịch chất hấp thụ. Dung dịch chỉ hấp thụ chọn lọc những photon nào có mức năng lượng phù hợp ᴠới các mức năng lượng điện tử, năng lượng dao động ᴠà năng lượng quaу của phân tử chất đó.

Như ᴠậу các phân tử ᴠật chất có cấu trúc khác nhau ѕẽ cho những phổ hấp thụ ᴠới các đỉnh ᴠà bước ѕóng đặc trưng khác nhau. OD sau nuôi cấy vi khuẩn được đo ở bước sóng 600 nm.

3.4. Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm Excel 2010 trong tính toán, xử lý số liệu.


CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định

Mẫu tôm được thu thập tại khu vực cập cảng đánh bắt cá của huyện Giao thủy, huyện Hải Hậu tỉnh Nam Định và các ao nuôi được xử lý bề mặt và thu thập mẫu nội tạng để phân lập vi sinh vật. Từ 10 mẫu tôm được thu thập để nghiên cứu. Các mẫu ruột tôm được nghiền mịn, sau đó pha loãng đến 10-4 trong nước muối sinh lý, dịch sau pha loãng (100 µl) được cấy trải trên đĩa môi trường LB, ủ ở 37oC trong 36 giờ. Sau thời gian ủ, các khuẩn lạc (vi khuẩn, Bacillus) được quan sát và đếm số lượng. Mật độ vi sinh vật được tổng hợp trong bảng 4.1

Bảng 4.1. Mật độ vi sinh vật từ ruột các mẫu tôm nước mặn


TT

Kí hiệu

Nguồn PL

Vi khuẩn tổng

số (cfu/g)

Bacillus

(cfu/g)

1

TO-N1

Ao nuôi tôm nước mặn, Hải

Hậu, Nam Định

2.0E+06

4.0E+04

2

TO-N2

Ao nuôi tôm nước mặn, Hải

Hậu, Nam Định

2.3E+06

1.30E+04

3

TO-N3

Ao nuôi tôm nước mặn, Hải

Hậu, Nam Định

7.30E+04

2.00E+03

4

TO-BN1

Biển, Hải Hậu, Nam Định

1.14E+06

2.5E+04

5

TO-BN2

Biển, Hải Hậu, Nam Định

1.32E+06

2.0E+04

6

TO-BN3

Biển, Hải Hậu, Nam Định

1.03E+06

3.0E+03

7

TO-BN4

Biển, Hải Hậu, Nam Định

1.05E+06

1.0E+03

8

TO-BT1

Biển, Hải Hậu, Nam Định

4.6E+06

2.0E+05

9

TO-BT2

Biển, Hải Hậu, Nam Định

5.8E+04

3.0E+03

10

TO-BT3

Biển, Hải Hậu, Nam Định

1.06E+05

1.1E+05


Từ 10 mẫu ruột tôm đã tiến hành phân lập 50 khuẩn lạc đặc trưng, thuần khiết. Các khuẩn lạc được nuôi cấy riêng rẽ trong bình tam giác 50 mL chứa 30 ml môi trường LB, ở 37oC, nuôi lắc 180 vòng/phút sau 48 giờ. Dịch nuôi được li tâm ở 6000 vòng/phút, trong 15 phút. Dịch nổi của mỗi khuẩn lạc được thử hoạt tính enzyme amylase, cellulase, protease trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng. Đồng thời dịch nổi cũng được nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn kiểm định trên đĩa thạch.

Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào amylase, cellulase, protease của 50 chủng vi sinh vật được trình bày trong bảng 4.2.

Bảng 4.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng phân lập từ ruột tôm.



Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng phân lập

TT

Tên kí hiệu

Amylase (mm)

Cellulase (mm)

Protease (mm)

1

TO-N1.1

28

18

21

2

TO-N1.2

-

13

20

3

TO-N1.3

-

-

-

4

TO-N3.1

18

15

17

5

TO-N3.2

-

-

-

6

TO-BN1.1

-

+

+

7

TO-BN1.2

-

-

-

8

TO-BN1.3

18

21

9

9

TO-BN2.1

-

22

8

10

TO-BN2.2

-

-

-

11

TO-BN3.1

17

21

9

12

TO-BN3.2

17

22

7

13

TO-BN3.3

-

-

-

14

TO-BN3.4

17

12

4

15

TO-BN4.1

13

10

13



16

TO-BN4.2

-

-

-

17

TO-BT1.1

-

-

-

18

TO-BT1.2

-

-

-

19

TO-BT2.1

-

6

23

20

TO-BT2.2

-

-

-

21

TO-BT2.3

-

-

-

22

TO-BT2.4

-

5

-

23

TO-BT3.1

-

26

-

24

TO-BT3.2

-

-

-

25

TO-BT3.3

-

-

-

26

BL1

8

11


27

BL2

13

8

5

28

BL3

15

14

8

29

N1.4

30

29

24

30

TO-N1.5

13

27

5

31

TO-N1.6

13

20

-

32

TO-N3.3

21

25

5

33

TO-N3.4

18

23

-

34

TO-N3.5

23

25

3

35

TO-N3.6

17

25

3

36

TO-N3.7

13

23

6

37

BL4

15

26

6

38

BL5

18

25

6

39

BL6

-

-

-

40

BL7

25

25

12

41

TO-N2.1

13

23

3

42

TO-N2.2

15

23

6

43

TO-BN2.3

13

25

3

..... Xem trang tiếp theo?
⇦ Trang trước - Trang tiếp theo ⇨

Ngày đăng: 11/06/2022