Bảng 3.12. IC50 của 6 mẫu saponin và 2 cao định lượng NP(O), NP(H) trên 6 dòng tế bào ung thưngười đã được thử nghiệm
MCF7 | HepG2 | HT29 | RD | SK LU1 | A549 | |
Mẫu(1)Rg1 | 14,87 ±3,20 | 12,32 ±3,20 | 13,59 ±3,20 | 12,21 ±3,20 | 12,63 ±3,20 | 11,87 ±3,45 |
Mẫu(2)Re | 12,84 ± 3,85 | 11,13 ± 2,94 | 11,85 ± 2,17 | 14,79 ± 3,25 | 6,83 ±0,81 | 7,92 ±0,37 |
Mẫu (3)Rd | 8,21 ± 0,39 | 12,57 ± 2,151 | 12,34 ± 3,22 | 9,17 ± 0,56 | 11,95 ±3,22 | 12,11 ±1,21 |
Mẫu(4)Rb1 | 8,09 ± 0,81 | 11,23 ± 2,48 | 12,36 ± 2,52 | 8,34 ± 0,37 | 13,68 ±1,05 | 12,56 ±3,81 |
Mẫu(5)Rg3 | 5,14 ± 0,41 | 4,54 ±0,42 | 5,08 ± 0,48 | 4,44 ± 0,42 | 9,88 ±0,47 | 8,01 ±0,58 |
Mẫu(6)Rh1 | 8,58 ± 0,59 | 7,31 ± 0,59 | 9,19 ± 0,82 | 6,48 ± 0,63 | 8,14 ±0,45 | 10,64 ±0,32 |
Mẫu chưa hấpNP(O) | 12,57 ± 1,84 | 12,16 ± 2,74 | 13,21 ± 1,17 | 11.34 ± 2,23 | 10,41 ± 2,26 | 10,32 ± 2,68 |
Mẫu đãhấp NP(H) | 8,89 ± 0,60 | 9,11 ± 0,44 | 7,03 ± 0,82 | 11,84 ±3,24 | 8,57 ±0,27 | 7,62 ±0,46 |
Ellipticine/tham chiếu (+) | 0,36 ± 0,02 | 0,41 ± 0,04 | 0,40 ± 0,04 | 0,45 ± 0,05 | 0,39 ±0,05 | 0,33 ±0,03 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Dữ Kiện Phổ 1H Và 13C-Nmr Của Các Hợp Chất Pn3, Pn4, Pn5 -
Các Hợp Chất Phân Lập Từ Thân Rễ Tam Thất (Pn1, Pn2, Pn6) Và Phổ Hmbc Chọn Lọc Của Hợp Chất Pn1 -
Đồ Thị Biểu Diễn Đường Chuẩn Của Các Saponin Đối Chiếu -
Kết Quả Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng U Của Các Cao Định Lượng Np(H) Và Np(O) Trên Chuột Nhắt Trắng Mang Khối U Rắn Sarcoma Tg 180. -
Kết Quả Đánh Giá Nồng Độ Il-2 Và Tnf-Α Máu (N = 10, Mean ± Sd). -
Kết Quả Đánh Giá Tác Dụng Kéo Dài Thời Gian Sống Thêm Của Cao Định Lượng Np(H) Và Np(O) Trên Chuột Mang Khối U Rắn Sarcoma Tg 180.
Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.
Từ các kết quả thu được trong cùng điều kiện thử nghiệm in vitro:
* So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người của 6 saponin đã thử nghiệm,kết quả cho thấy:
Mẫu thử Rg1(1) có hoạt tính ức chế yếu sự phát triển của các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml).
Mẫu thử Re (2)thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển đối với dòng tế bào SK LU1 với giá trị IC50 là 6,83 ±0,81µg/ml và đối với dòng tế bào A549 là 7,92 ± 0,37µg/ml; các dòng tế bào còn lại sự ức chế phát triển đều ở mức yếu (IC50>10
µg/ml).
Mẫu thử Rd (3)cũng thể hiệnhoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF7 và RD đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 8,21± 0,39 µg/ml đến
9,17± 0,56 µg/ml và chưa thể hiện hoạt tính trên các dòng HepG2, HT-29, SK LU1 và A549 ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml).
Mẫu thử Rb1 (4) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF7 và RD đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 8,09 ± 0,81µg/ml đến 8,34
± 0,37 µg/ml và chưa thể hiện hoạt tính trên các dòng HepG2, HT-29, SK LU1 và A549 ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml).
Mẫu thử Rg3 (5) có hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 4,44 ± 0,42 µg/ml đến 9,88± 0,47 µg/ml;
Mẫu thử Rh1 (6) có hoạt tính ức chế sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm với giá trị IC50 từ 6,48 ± 0,63 µg/ml đến 9,19 ± 0,82 µg/ml.
Như vậy đối với 6 hợp chất tinh khiết phân lập được thì có 4 hợp chất là Rg1, Re2, Rd3 và Rb1có hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm in vitro tương đối yếu so với 2 hợp chất tinh khiết thu được sau khi hấp qua hơi nóng thu được là Rg3 và Rh1.
Nói một cách khác, 2 hợp chất Rg3 và Rh1 thu được sau khi Tam thất đã xử lý hấp qua hơi nóng ở 120 độ C trong vòng 8 giờ có hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với 4 hợp chất Rb1, Rd, Re và Rg1 khi được thử trên 6 dòng tế bào ung thư trong cùng điều kiện.
** So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người đã thử nghiệm với 2 cao định lượng NP(O), NP(H), kết quả cho thấy
So sánh hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người đã thử nghiệm,cao định lượng NP(H) (cao định lượng Tam thất sau khi hấp) có hoạt tính ức chế tương đối mạnh sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư là HT29, HepG2, MCF7, SK LU1 và A549 đã thử với giá trị IC50 từ 7,03 đến 9,11 µg/ml, chỉ chưa thể hiện hoạt tính trên một dòng tế bào ung thư là RD ở các nồng độ đã được thử (IC50>10 µg/ml).
Trong khi đó NP(O) (cao định lượng Tam thất chưa qua hấp) không thể hiện
hoạt tính ức chế sự phát triển của cả 6 dòng tế bào ung thư đã được thử ở tất cả các nồng độ đã sử dụng (với tất cả các dòng này đều có IC50>10 µg/ml).
3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào và khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.
3.2.2.1. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào của cao định lượng NP(H)
*Ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) tới hình thái tế bào
Sự biến đổi hành thái đặc trưng của tế bào là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độc tính của các chất lên các tế bào ung thư nuôi cấy.
A
B
Hình 3.9. Hình thái tế bào Sarcoma TG180
(A) Tế bào đối chứng sinh học.
(B) Tế bào được xử lý với dung môi 0,5% DMSO tại thời điểm 48h (VK10X15) Qua hình 3.11, không có sự sai khác giữa 2 giếng: tế bào đối chứng sinh học (Hình 3.11A) và tế bào được xử lý với môi trường 0.5% DMSO (Hình 3.11B), điều này cho thấy môi trường chứa 0,5% DMSO (dung môi pha thuốc) không có tác
động đáng kể nào lên tế bào.
(A) | (B) | (C) | (D) | (E) | (F) |
2000µg/ml | 1000µg/ml | 500µg/ml | 250µg/ml | 125µg/ml | 62,5µg/ml |
Tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của Taxol tại các nồng độ thử nghiệm | |||||
(A1) | (B1) | (C1) | (D1) | (E1) | (F1) |
2µg/ml | 1µg/ml | 0,5µg/ml | 0,25µg/ml | 0,125µg/ml | 0,0625µg/ml |
Tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của NP(H) tại các nồng độ thử nghiệm
Hình 3.10. Hình thái tế bào Sarcoma TG180 dưới tác dụng của cao định lượng
NP(H) và thuốc chứng dương Taxol tại thời điểm 48h (VK10X15)
Qua hình thái tế bào thu được sau 48h ủ với cao định lượng NP(H), chúng tôi nhận thấy NP(H) có thể hiện rõ tác dụng gây độc cho tế bào. Tại các nồng độ 2000µg/ml (hình 3.12 A) và 1000µg/ml (hình 3.12 B), số lượng tế bào giảm rõ rệt, hình thái không còn nguyên vẹn, phần lớn, đến 90% tế bào đã vỡ, phân mảnh. Khi giảm nồng độ xuống
½, cụ thể tại Hình 3.12 C, D, E và F, hình thái tế bào phục hồi dần, tạo cụm đặc trưng. Ở nồng độ 250µg/ml (hình 3.12 D) mật độ tế bào đạt khoảng 40% so với giếng đối chứng. Khi giảm đến nồng độ 125 µg/ml (hình 3.12 E) và nồng độ 62,5 µg/ml (hình 3.12 F), mật độ tế bào đạt mức như giếng đối chứng.
Với thuốc chứng dương Taxol ở những nồng độ 2µg/ml (hình 3.12 A1), và 1µg/ml (hình 3.12 B1), mật độ tế bào cũng giảm nhiều, số lượng chỉ khoảng 15- 20%, tuy nhiên những tế bào quan sát thấy, vẫn tròn đều, màng sáng, có xu hướng tạo cụm đặc trưng. Khi giảm dần nồng độ thuốc thử, mật độ tế bào cũng tăng dần
và hình thái trở về trạng thái sinh lý bình thường (hình 3.12 C1 và hình 3.12 D1). Khi giảm đến nồng độ 0,125 µg/ml(hình 3.12 E1) và nồng độ 0,0625 µg/ml (hình
3.12 F1), mật độ tế bào đạt mức như giếng đối chứng.
* Kết quả thử nghiệm MTS
MTS[3-(4,5-dimethylthiazol–2-yl)–5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl) - 2H-tetrazolium] là một loại mới của muối tetrazolium, nó có thể bị khử bởi các tế bào sống tạo ra sản phẩm là formazan hòa tan trực tiếp trong môi trường nuôi cấy tế bào.
Thuốc thử tetrazolium này được sử dụng kết hợp với thuốc thử nhận điện tử trung gian là phenazine methyl sulfate (PMS) hoặc phenazine ethyl sulfate (PES), có thể xâm nhập vào các tế bào sống, bị khử trong tế bào chất hoặc ở bề mặt tế bào và giải phóng ra khỏi tế bào nơi chúng có thể chuyển đổi tetrazolium thành sản phẩm formazan hòa tan.
Nồng độ formazan hình thành được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 490nm. Quá trình khử xảy ra dưới sự xúc tác của enzym trong ty thể trong tế bào sống, theo đó hàm lượng của chất tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống tham gia phản ứng.
Phương pháp MTS có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau. Kết quả thu được cho ra giá trị IC50, từ đó đánh giá được độ độc của thuốc cần nghiên cứu.
Như ở phần phương pháp đã nêu ở trên, chúng tôi thử độc tính các mẫu nghiên cứu gồm 6 nồng độ, nồng độ thử cao nhất là 2000µg/ml đối với cao định lượng NP(H), 2µg/ml đối với thuốc chứng dương Taxol và giảm dần mỗi nồng độ được giảm ½ nồng độ trước nó.
Sau 48h ủ thuốc, bằng phương pháp MTS, chỉ số OD được đo tại bước sóng 490, bằng máy đọc ELISA (SpectraMAX Plus 384).
Kết quả OD đo được tương đối phù hợp với kết quả định tính so sánh hình thái ở trên, bằng các phương pháp thống kê trong Excel chúng tôi xử lý số liệu và thu được kết quả về % tế bào sống (A%) tương ứng với các nồng độ thử, kết quả thể hiện qua bảng 3.13.
Bảng 3.13. Tỷ số tăng sinh (A%) và giá trị IC50 các mẫu nghiên cứu trên dòng Sarcoma TG180
Sarcoma TG180/chất thử(*) | ||||
NP(H) | Taxol | |||
A% Lần 1 | A% Lần 2 | A% Lần 1 | A% Lần 2 | |
2000 | 14,41 | 13,73 | 23,79 | 20,64 |
1000 | 21,02 | 21,83 | 37,79 | 36,24 |
500 | 32,42 | 33,36 | 49,55 | 53,45 |
250 | 47,83 | 50,82 | 56,19 | 59,08 |
125 | 62,75 | 61,18 | 62,75 | 68,66 |
62,5 | 101,47 | 91,77 | 104,61 | 92,62 |
TB IC50 | IC50=206,65±10,11 (µg/ml) R2=0,96 | IC50=0,701 ±0,266 (µg/ml) R2=0,98 | ||
3.2.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.
Sau thời gian 12h, 24h và 48h ủ tế bào ung thư mô liên kết chuột Sarcoma 180 với cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml, tiến hành thu tế bào từ các giếng thí nghiệm cũng như đối chứng.
Để xác định tỉ lệ tế bào chết theo chương trình chúng tôi sử dụng bộ kít anti- annexin V gắn chất phát huỳnh quang là Fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất
nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là 7-Amino Actinomycin D (7AAD). Quy trình chạy flow cytometrytheo hướng dẫn của bộ kit Annexin V Apoptosis Detection (BD) trên máy đếm tế bào BDFACS-Lysis Của hãng BD Mỹ, tại Labo Sinh học phân tử- Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y.
Các tế bào apoptosis được nhận biết bằng sự dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+). Kết quả đánh giá tỷ lệ % tổng tế bào Apoptosisđược trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Tỷ lệ % tế bào apoptosis
Tỷ lệ tế bào apoptosis (%) | Tỷ lệ %so với đối chứng | |||
Mẫu 1 | Mẫu 2 | Trung bình | ||
Chứng | 4,75 | 3,41 | 4,08 | 100% |
12h | 6,13 | 5,91 | 6,02 | 147,55 |
24h | 9,58 | 8,44 | 9,01 | 220,83 |
48h | 10,08 | 8,62 | 9,35 | 229,17 |
Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy cao định lượng NP(H) có khả năng kích thích tế bào Sarcoma TG180 chết theo kiểu apoptosis. Cùng một nồng độ thuốc thử (cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml), thời gian ủ càng lâu thì tỷ lệ tế bào apoptosis càng cao. Cụ thể tại thời điểm sau 12h, 24h và 48h ủ, tỷ lệ tế bào apoptosis tương ứng là147,55%; 220,83% và 229,17% so với đối chứng.
Các tế bào apoptosis được phân chia ra thành những tế bào apoptosis sớm và tế bào apoptosis muộn. Tế bào apoptosis sớm là những tế bào mà sự chết được cảm ứng, khởi phát và được định hướng ngay giai đoạn đầu hay giai đoạn sớm của quá trình apoptosis, lúc này trong tế bào mọi hoạt động sống vẫn diễn ra. Những thay đổi trong màng sinh chất là một trong những đặc điểm sớm nhất của quá trình apoptosis, do đó ở các tế bào apoptosis sớm chỉ có sự dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+).Sự phân mảnh DNA trong nhân tế bào apoptosis
sớm chưa xảy ra, do đó tế bào âm tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin (7-AAD-).
Kết quả đánh giá tỷ lệ % tế bào Apoptosis sớm được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Tỷ lệ tế bào Appotosis sớm
Tỷ lệ chết apoptosis sớm % | Tỷ lệ apoptosis so với đối chứng | |||
Mẫu 1 | Mẫu 2 | Trung bình | ||
Chứng | 1,36 | 1,08 | 1,22 | 100% |
12h | 1,89 | 1,90 | 1,90 | 155,74 |
24h | 3,00 | 2,71 | 2,86 | 234,43 |
48h | 3,38 | 3,78 | 3,58 | 293,44 |
Kết quả ở bảng 3.15 cho thấy cao định lượng NP(H) làm tăng tỷ lệ tế bào Appotosis sớm. Cùng một nồng độ thuốc thử (cao định lượng NP(H) tại nồng độ 103,3 µg/ml), thời gian ủ càng lâu thì tỷ lệ tế bào apoptosis sớm càng cao. Cụ thể tại thời điểm sau 12h, 24h và 48h ủ, tỷ lệ tế bào apoptosis sớm tương ứng là 155,74%; 234,43% và 293,44% so với đối chứng.
Tế bào apoptosis muộn là những tế bào mà quá trình apoptosis đã ở giai đoạn muộn,có những thay đổi đáng kể về hình thái xảy ra và một đặc trưng cơ bản là sự phân mảnh DNA trong nhân sau sự cô đặc thể nhiễm sắc, các hoạt động sống của tế bào gần như đã dừng, màng tế bào lúc này không còn các phản ứng chọn lọc. Khi không kiểm soát, đồng nghĩa với việc tế bào cho tất cả các chất qua màng, chính vì vậy ngoài dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+), tế bào còn dương tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin (7-AAD+).7-AAD là thuốc nhuộm huỳnh quang có ái lực cao với DNA sợi kép, khi được kích thích bằng nguồn sáng thích hợp, tế bào chết biểu hiện cường độ huỳnh quang, dễ dàng nhận biết và đếm bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy.
Kết quả đánh giá tỷ lệ % tế bào Apoptosis muộn được trình bày ở bảng 3.16.