Phương Pháp Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Môi Trường Nuôi Cấy Lên Sinh Khối Và

b. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinumtrong điều kiện in vitro

 Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml) trên các đĩa Petri môi trường PGA.

 Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trên môi trường PGA tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (5 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PGA) vào mép khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày.

 Sau mỗi ngày thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với xanh metylen loffer và soi dưới kính hiển vi [10].

2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum‌

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử

Tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong các bình tam giác 250ml chứa môi trường Czapek-Dox Broth (100 ml/ bình) với các giá trị pH khác nhau: 6, 6.5, 7,

7.5. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.

Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử bằng cách cho dịch nuôi cấy lọc qua giấy lọc kích thước 15-20 μm thu lấy sinh khối trên giấy lọc và dịch lọc chứa bào tử. Việc thu sinh khối và dịch bào tử được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [17].

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ và Cacbon đến sinh khối và số lượng bào tử

Tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường Czapek-Dox Broth nhưng thay thế nguồn nitơ cao nấm men bằng nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.

- Sau 14 ngày nuôi cấy trong các bình tam giác tiến hành thu sinh khối và bào tử. Cách thu sinh khối và bào tử tiến hành tương tự như ở mục 2.5.9.1

- Tương tự ảnh hưởng của nguồn cacbon cũng tiến hành nuôi cấy trong môi trường Czapek- Dox Broth nhưng thay thế glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau như: huyền phù tinh bột, saccharose. Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử.

2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov‌

- Sinh khối nấm sợi được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối.

- Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối nấm sợi bằng HCl 1N và nước cất. Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối nấm sợi ở 80- 105 °C đến trọng lượng không đổi. Sinh khối đựơc tính theo sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân trước đó [3].

2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật‌

Nguyên tắc:

- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri.

- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.

Cách lấy mẫu

- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5 để cấy mẫu.

- Ghi vào nắp hộp Petri có mội trường thạch các thông tin:

- Nồng độ pha loãng.

- Ngày cấy.

- Dùng pipet đã vô trùng lấy 0.1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch.

- Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào.

- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình.

- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp [8].

- Cách đếm

Số tế bào/g mẫu = M.a.10 n .N

M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa. A: số giọt trong 1ml dịch mãu.

n: hệ số pha loãng.

2.5.11. Các phương pháp khác‌

Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic plus 5 [5]. Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Excel [4].

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN‌

3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng‌

3.1.1. Phân lập‌

Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm từ các mẫu xác côn trùng bị nhiễm nấm theo mục 2.5.1. Tiến hành định danh sơ bộ bằng các phương pháp ở mục 2.5.3 và căn cứ vào đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc chúng tôi phân lập được 1 chủng nấm.

Hình 3.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum

3.1.2. Định danh‌

Sau khi phân lập và làm thuần, tiến hành định danh sơ bộ nấm bằng cách nuôi chủng nấm này trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày. Tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc. Làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cấu trúc hệ sợi (sự phân nhánh, vách ngăn của sợi nấm), màu sắc sợi nấm, hình dạng và cấu trúc cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, thể bình, bào tử).

Kết quả định danh sơ bộ

Quan sát đại thể

Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum ( PGA, 7 ngày, 28 °C) Quan sát vi thể

Hình 3. 3: Cấu trúc hệ sợi nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN TRÁI) và cơ quan sinh sản của nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN PHẢI)

Hình 3.4: Cấu trúc thể bình và cách sắp xếp bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ( 400)

So sánh giữa kết quả quan sát được với khoá phân loại của R.A. Samson (1974) Đặc điểm phân loại chủng nấm

Đặc điểm chủng nấm A

Đặc điểm phân loại chi Paecilomyces

 Bề mặt khuẩn lạc nhẵn, mịn như nhung. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu tím.

 Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh và trong suốt không màu.

 Cuống sinh bào tử phân nhánh thẳng đứng.

 Khuẩn lạc của Paecilomyces mọc nhanh và trưởng thành trong vòng 3 ngày. Màu sắc khuẩn lạc thì bắt đầu từ màu trắng trở nên vàng, vàng xanh, vàng nâu, nâu olive, cuối cùng có màu hồng hoặc tím phụ thuộc tuỳ loài.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 84 trang tài liệu này.

 Bào tử hình elip đến hình trụ, không màu. Bào tử xếp thành chuỗi dài và không phân nhánh.

 Thể bình có cấu trúc phình ở phần gốc và dần dần hẹp kéo dài thành cái cổ.

 Bào tử được sắp xếp trong chuỗi từ đầu mút của thể bình, chuỗi bào tử không phân nhánh. Bào tử không màu hoặc sáng màu.

 Thể bình phình ở phần gốc dần dần thuôn nhọn kéo dài thành một cái cổ. Thể bình phân chia thành thể bình cấp 1 hoặc cấp 2…

So sánh kết quả quan sát được và đặc điểm mô tả trong khoá phân loại của R.A. Samson (1974) chúng tôi kết luận chủng nấm A thuộc chi Paecilomyces.

Sau đó chúng tôi gửi chủng nấm Paecilomyces A đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để định danh bằng cách giải trình tự ribosome 28S và so sánh với ngân hàng gen NCBI.

Kết quả giải trình tự gen 28S

• TTTAAGTCCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG GCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAG GGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTC CCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCC GCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAA ACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAG CAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATC GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCA TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGT TGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCA GCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGC

So sánh kết quả với ngân hàng gen cho thấy chủng Paecilomyces A có độ tương đồng với loài nấm Purpureocillium lilacinum là 99%.

3.2. Kết quả định danh tuyến trùng‌

Sử dụng phương pháp định danh bằng hình thái và đối chiếu với khoá phân loại tuyến trùng ký sinh thực vật của tác giả Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000).

Hình 3.5: Hình thái toàn bộ cơ thể tuyến trùng (bên trái 400), đầu tuyến trùng (bên phải 1000)

Hình 3.6: Hình thái phần thân tuyến trùng (1000)

Hình 3.7: Hình thái cơ quan sinh sản của tuyến trùng (1000)

Hình 3.8: Hình thái phần đuôi tuyến trùng (1000)

So sánh với khoá phân loại của hai tác giả trên chúng tôi thu được loài tuyến trùng thuộc giống

Meloidogyne sp. với các đặc điểm sau: Thuộc bộ Tylenchida:

 Có phasmid. Vỏ cutin luôn luôn phân đốt.

 Không có tơ cứng trên bề mặt cutin.

 Có stylet (kim hút). Thực quản có diều giữa dạng cơ và diều sau dạng tuyến.

 Vùng môi thường kitin hoá mạnh. Kim hút rất phát triển. Lỗ đổ của tuyến thực quản lưng không đổ vào diều giữa mà đổ sau stylet một khoảng cách.

Thuộc họ Heteroderidae:

 Cutin phân đốt nhỏ đến trung bình. Vùng đầu phát triển và kitin hoá ở mức độ khác nhau. Diều giữa tách biệt con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng, nếu một thì có túi sau vulva. Con đực có cánh đuôi hoặc không.

 Stylet khoẻ. Diều giữa của con cái phát triển dạng tròn hoặc ovan, phần diều tuyến dạng quả lê hoặc dạng thuỳ kéo dài. Con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng. Đuôi từ tròn, tù, hình trụ đến hình chóp.

 Thực quản tuyến ở dạng thuỳ, không tạo thành hành thực quản, bao phủ phần đầu của ruột về phía lưng hoặc phía bụng. Stylet trung bình nhưng khoẻ.

 Con cái hình tròn hoặc hình quả lê. Con đực với đuôi ngắn, tròn, không có cánh đuôi. Giống Meloidogyne:

 Dị hình sinh dục. con cái trưởng thành hình quả lê hoặc hình cầu, nằm sâu trong mô rễ. Đường kính cơ thể 0.5-0.7mm với cổ cân đối. Vulva ở phía sau gần hậu môn. Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Stylet ngắn, kitin hoá trung bình.Vùng đầu kitin hoá không mạnh. Lỗ bài tiết nằm ở phía trước đến van diều giữa và thường gần gốc stylet. Hai nhánh sinh dục được cuộn gấp lại. Trứng được đẻ bên ngoài cơ thể vào khối gelatin.

 Con đực hình giun sống tự do trong đất; dài 1-2mm. Vùng đầu kitin hoá mạnh. Đuôi ngắn, hình cầu. Gai giao cấu phát triển mạnh, không có cánh đuôi.