Môi Trường Phân Lập, Giữ Giống Nấm Purpureocillium Lilacinum (Môi Trường Potato Glucose Agar-Pga )‌

1.3.2. Môi trường nuôi cấy‌

Trong quá trinh nuôi cấy nhân giống vi sinh vật môi trường nuôi cấy cần các nguyên tố đa lượng (C, H, O, N, S, P, Mg) và một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng (Mn, Bo, Co, Cu…).

Trong số các nguyên tố đa lượng thì C và N có ảnh hưởng rất lớn đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm sợi [7]

1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon‌

Cacbon tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào, từ tế bào chất đến thành tế bào, từ phân tử enzyme đến acid nucleic. Vì vậy hợp chất carbohydrat có ý nghĩa hàng đầu đối với sự sống của tế bào vi sinh vật.

Nguồn carbohydrat vi sinh vật sử dụng được rất phong phú. Từ dạng tinh khiết (glucose, saccharose…) đến dạng tạp chất (rĩ đường, dịch kiềm sunfite…). Một số nhóm vi sinh vật sử dụng được cả khí thiên nhiên, hydrocacbon (methane, alkan…).

1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen‌

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 84 trang tài liệu này.

Nitrogen tham gia vào các thành phần cấu trúc nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Nguồn nitrogen là nguồn dinh dưỡng quan trọng không kém gì nguồn cacnon.

Nitrogen được cung cấp cho tế bào dưới nhiều dạng khác nhau:

Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4+, NO3-, pepton các loại, các amino acid.

Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng nguồn nitrogen dưới dạng sản phẩm thô gọi là nguồn nitrogen kĩ thuật bao gồm các loại sau: dịch thuỷ phân nấm men, bột đậu nành, cao ngô, khô lạc hay bánh dầu phông, nước mắm, nước tương [7].

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU‌

2. 1. Vật liệu‌

- Côn trùng bị nhiễm nấm trên lá cây chanh, bưởi, sung.

- Đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng nốt sưng.

2. 2. Thiết bị và dụng cụ‌

Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp vô trùng Cân phân tích Metuyến trùngler AE 260

Kính hiển vi quang học Leca Tủ sấy

Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 800 Bếp gas

Máy chụp hình Máy đo pH Thermo Lò vi sóng National

Dụng cụ

- Ống nghiệm, bình erlen, lam và lamen, đĩa Petri, đũa thủy tinh, bình đựng mức, cốc đong, que trans.

- Que cấy đầu vuông, kim mũi mác.

- Pipet, vải muslin 2 lớp, giấy thấm.

- Rây lọc có khích thước lỗ khác nhau: 0.5mm, 15 μm.

- Que gắp tuyến trùng, các giếng, đĩa đếm tuyến trùng, bình hút ẩm.

2. 3. Hóa chất‌

 Glycerol Methyl blue

 Agar Cao nấm men

 Glucose NaNO3

 KNO3 Ethanol 96

 (NH4)2SO4 NaClO

 MgSO4.7H2O NaCl

 Ampicilline K2HPO4

 KH2PO4 Huyền phù tinh bột

 Saccharose Formaldehyt 40%

2. 4. Môi trường‌

2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA )‌

Khoai tây 200g

Glucose 20g

Agar 20g

Nước cất 1000 ml

2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth)‌

Cao nấm men 3 g

Glucose 20 g

K2HPO4 0.5 g

KH2PO4 0.05 g

MgSO4.7H20 0.5 g

NaCl vài mg

Nước cất 1000ml

2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA)‌

Glucose 20g

Cao nấm men 4g

Agar 20g

Nước cất 1000ml‌

2. 5. Các phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp phân lập‌

a. Phương pháp thu mẫu

Thu thập những xác côn trùng vào buổi sáng. Nếu cơ thể chúng mềm và bẩn, chúng có thể bị nhiễm vi khuẩn hoặc virus. Nếu cơ thể chúng cứng, điều đó chứng tỏ sự nhiễm nấm.

Tiến hành thu mẫu ở 3 khu vực khác nhau trên 3 đối tượng cây trồng là: chanh, bưởi, sung. Mỗi khu vực thu thập 10 mẫu. Vì số lượng côn trùng bị bệnh thu được rất ít nên chúng

tôi tiến hành phối trộn chung hết tất cảc các mẫu thu được. Sau đó tiến hành các phương pháp phân lập [6].

b. Phương pháp phân lập

Tiến hành khử trùng mẫu xác côn trùng bằng HgCl2 0.1%. Sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần.

Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng nghiền mẫu với 10ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.

Dùng pipet vô trùng hút 0.1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PGA [6].

c. Phương pháp làm thuần (Phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng nấm)

Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm là quá trình cấy truyền đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm để tạo một mẫu nấm thuần

- Đổ môi trường PGA vào đĩa Petri để nghiêng sao cho phần thạch ở một phía của đĩa nông.

- Cấy truyền một miếng nhỏ nấm từ đĩa phân lập vào một bên đĩa nơi thạch sâu hơn.

- Đặt đĩa dưới kính lúp soi nổi và điều chỉnh tiêu điểm sợi nấm ở rìa tản nấm (Các sợi nấm sẽ mọc rất thưa ở phần nông của thạch)

- Điều chỉnh nguồn sáng (gương) nhằm đạt độ tương phản tốt giữa môi trường và sợi nấm.

- Dùng que cấy dẹp đã khử trùng cấy một miếng thạch nhỏ chứa đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm sang một đĩa môi trường thích hợp.

2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng‌

 Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PGA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp xong để nghiêng một góc 45 ° C các ống thạch này trên giá gỗ.

 Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các ống giống này trong điều kiện lạnh (3-5 ° C)

 Thời gian cấy truyền lại đối với nấm mốc là 3-6 tháng [8].

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi‌

a. Quan sát đại thể

Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống. Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống giống, sau đó lăn nhẹ ngón tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy nhẹ 1 điểm vào đĩa Petri có chứa môi trường PGA. Quan sát từng ngày khuẩn lạc về các đặc điểm sau:

- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc.

- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc.

- Hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi nấm.

- Giọt tiết.

- Sắc tố tiết vào môi trường.

b. Quan sát vi thể (tiêu bản phòng ẩm)

 Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng chứa lam, lamen và một miếng giấy lọc.

 Chuẩn bị một đĩa Petri môi trường PGA với độ dày môi trường thật mỏng.

 Dùng kim mũi mác vô trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa Petri môi trường PGA (kích thước miếng thạch 1x1cm) dặt lên lam chứa trong đĩa Petri vô trùng được chuẩn bị ở trên.

 Dùng que cấy đầu vuông lấy một ít bào tử nấm Purpureocillium lilacinum từ các ống giống chấm vào 2 điểm đối diện của miếng thạch PGA trên lam. Sau đó đậy lamen lên và dùng nước cất vô trùng làm ướt miếng giấy lọc trong đĩa Petri.

 Sau 3 ngày nuôi cấy lấy tiêu bản phòng ẩm ra và nhuộm bằng xanh metylen loffer. Quan sát tiêu bản phòng ẩm dưới kính hiển vi về các đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm (có hay không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách sắp xếp bào tử [3].

2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử‌

 Thu nhận DNA

 Phá màng tế bào và màng nhân bằng proteinase đặc hiệu để giải phóng DNA, đồng thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.

 Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA.

 Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.

 Chạy PCR

 Biến tính: trong một hỗn hợp đầy đủ các thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (khoảng 94°-95° C), trong 30 giây-1 phút.

 Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40°-70° C và kéo dài trong vòng 30 giây- 1 phút.

 Tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72° C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây- vài phút.

 Giải trình tự DNA [3].

2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng‌

Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri.

Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri [2].

2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng‌

Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi. Nếu mẫu có ít tuyến trùng:

 Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm. sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều.

 Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa.

Nếu mẫu quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30ml, sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vây, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1ml rồi nhân với 30 [2].

2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái‌

a. Phương pháp xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng theo De Grisse (1969)

 Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng có chứa 0.5ml dung dịch I (99ml Formalin 40% + 1 ml glycerine). Với mỗi mẫu nhặt khoảng 200 con để định loại, với mẫu có ít tiến hành định loại toàn bộ mẫu. Đặt giếng có tuyến trùng (có đậy lam kính) vào bình hút ẩm chứa 1/10 thể tích ethanol 96 %. Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ 40 °C ít nhất 12 giờ.

 Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II ( 95ml ethanol 96%

+ 5 ml glycerine) vào giếng, đậy lam kính lên giếng để ethanol bay hơi chậm và đặt trong tủ ấm. Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần. Quá trình này nhằm làm mất nước tuyến trùng. Để giếng trongâm1 qua đêm, bổ sung vài giọt dung dịch III (50ml ethanol 96%+ 50ml glycerine) giúp làm mất nước và làm trong tuyến trùng.

Ngày thứ 3: tuyến trùng đã được sử lý làm mất nước, làm trong nằm trong dung dịch glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại [1].

b. Phương pháp lên tiêu bản tuyến trùng theo Maeseneer (1963)

 Hơ nóng ống đồng và cắm vào đĩa paraffin. Sau đó chấm ống đồng lên lam để tạo thành vòng paraffin .

 Nhỏ một giọt glycerine thuần khiết vào giữa vòng paraffin. Dùng que gắp tuyến trùng đã được xử lý trong các giếng vào giọt glycerine (khỏang 5-10 tuyến trùng, chú ý các con tuyến trùng phải xếp cùng chiều và không chồng lên nhau).

Đặt khoảng 3 viên paraffin xung quanh vòng paraffin sau đó đậy lamen lên. Đặt lam và lamen có tuyến trùng lên thanh sắt nóng cho paraffin chảy ra [1].

c. Phương pháp định danh tuyến trùng

 Quan sát dưới kính hiển vi quan học lần lượt ở các vật kính 10X, 20X, 40X, 100X. Phác hoạ sơ bộ hình thái tuyến trùng như: kích thước, có kim hút hay không có kim hút, hình dạng vùng môi, cơ quan sinh dục…

 Dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng cho từng nhóm tuyến trùng như: lớp cutin, amphid, vùng môi, buồng trứng, kim hút để định loại. sử dụng khoá phân loại theo tài liệu của Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000) [1].

2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro‌

a. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum

Cách tiến hành:

 Chuẩn bị huyền phù trứng tuyến trùng:

 Dùng kim mũi mác tách lấy khối trứng tuyến trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất. Cho thêm 4-5 ml NaClO 1,05% vào lắc trong vòng 5 phút. Sau đó để yên cho các mãnh vở lắng xuống trong 30 giây.

 Dùng pipet hút phần trong ở phía trên của ống nghiệm chuyển lên ray lọc kích thước 15 μm. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa sạch NaClO.

 Chuyển ray lọc chứa trứng tuyến trùng vào đĩa Petri chứa dung dịch ampicilline 0.1% để khử trùng trong 10 phút. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa lại [14].

Bố trí thí nghiệm: lô thí nghiệm: 1ml huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml) + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml) cho vào ống nghiệm.

 Lô đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml). Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 1 tuần.

 Thu kết quả: quan sát và đếm số lượng trứng không nở, IJ2 chết, IJ2 sống trong các đĩa đếm tuyến trùng dưới kính lúp sôi nổi. Đối với trứng tuyến trùng bị ký sinh bởi nấm Purpureocillium lilacinum dùng kim tiêm 500cc thu ngẫu nhiên 100 trứng tuyến trùng chuyển lên lam nhuộm bằng xanhmethylen loffer và quan sát bằng kính hiển vi [10], [14].

 Cách đánh giá kết quả:

Tỉ lệ trứng không nở= số trứng không nở/ (trứng + IJ2)X 100 Tỉ lệ IJ2 chết= IJ2 chết/ tổng IJ2x100

..... Xem trang tiếp theo?
⇦ Trang trước - Trang tiếp theo ⇨

Xem tất cả 84 trang.

Ngày đăng: 29/05/2022