Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp Cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số cyclooligomer depsipeptide (COD) phổ biến ở nấm 11

Bảng 1.2. Khả năng ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư của một số COD. 15 Bảng 1.3. Khả năng kháng khuẩn của beauvericin 17

Bảng 1.4. Thành phần một số loài thuộc chi Beauveria, Fusarium và Isaria

sinh tổng hợp COD 19

Bảng 2.1. Môi trường lên men thu nhận COD 43

Bảng 2.2. Các trình tự được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài trên ba vùng gen ITS, LSU, Rpb1 51

Bảng 2.3. Phương pháp thực nghiệm khảo sát và thí nghiệm sau khảo sát tách chiết, tinh sạch COD 53

Bảng 3.1. Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập được 84

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 228 trang tài liệu này.

Bảng 3.2. Khả năng sinh tổng hợp COD của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở khu vực nghiên cứu 88

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của CC1 và tài liệu tham khảo 120

Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V 124

Bảng 3.5. Hoạt tính chống oxi hóa in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V 125

Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của cao chiết và beauvericin từ chủng nấm C. cateniannulata CPA14V 126

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc một số loại cyclooligomer depsipeptide 9

Hình 1.2. Cấu trúc chung của các liên kết este giữa nhóm carboxyl C-terminus α- hydroxy acid, ß-hydroxy acid và hydroxy- acid chuỗi dài 10

Hình 1.3. Cấu trúc Pseudoxylallemycin 12

Hình 1.4. Cấu trúc một số diketomorpholine 13

Hình 1.5. Sinh tổng hợp COD 25

Hình 1.6. Con đường sinh tổng hợp beauvericin 30

Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn xác định COD tích lũy theo 56

Hình 3.1. Hình thái mẫu CPA1 58

Hình 3.2. Hình thái mẫu CPA3 59

Hình 3.3. Hình thái mẫu CPA5 60

Hình 3.4. Hình thái mẫu CPA13V 61

Hình 3.5. Hình thái mẫu CPA14V 62

Hình 3.6. Hình thái mẫu CPA15 63

Hình 3.7. Hình thái mẫu CPA16 64

Hình 3.8. Hình thái mẫu CPA31 64

Hình 3.9. Hình thái mẫu CPA40 65

Hình 3.10. Hình thái mẫu CPA44 66

Hình 3.11. Hình thái mẫu XS01 67

Hình 3.12. Hình thái mẫu XS07 68

Hình 3.13. Hình thái mẫu XS12 69

Hình 3.14. Hình thái mẫu XS36 70

Hình 3.15. Hình thái mẫu XS37 71

Hình 3.16. Hình thái mẫu XS38 72

Hình 3.17. Hình thái mẫu XS57 73

Hình 3.18. Hình thái mẫu XS65 74

Hình 3.19. Hình thái mẫu XS66 75

Hình 3.20. Hình thái mẫu XS67 76

Hình 3.21. Hình thái mẫu XS69 77

Hình 3.22. Hình thái mẫu XS71 78

Hình 3.23. Hình thái mẫu XS77 79

Hình 3.24. Hình thái mẫu XS83 80

Hình 3.25. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu 82

Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC UV 203 nm của chất chuẩn (A) 90

Hình 3.27. Đặc điểm hình thái của chủng Cordyceps sp. CPA14V 92

Hình 3.28. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen 94

Hình 3.29. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen LSU 97

Hình 3.30. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên 3 vùng gen ITS1-5.8S rDNA-ITS2, LSU và Rpb1 98

Hình 3.31. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng nấm C. cateniannulata CPA14V trong 05 loại môi trường nghiên cứu 100

Hình 3.32. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng

C. cateniannulata CPA14V 103

Hình 3.33. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V 105

Hình 3.34. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp COD của chủng C. cateniannulata CPA14V 107

Hình 3.35. Quy trình thu nhận COD (CC1) quy mô phòng thí nghiệm 111

Hình 3.36. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng CC1 112

Hình 3.37. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CC1 113

Hình 3.38. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng CC1 113

Hình 3.39. Phổ LC/MS Q-TOF của CC1 114

Hình 3.40. Phổ 1H-NMR của CC1 115

Hình 3.41. Phổ 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HSQC của CC1 117

Hình 3.42. Phổ COSY, phổ NOESY và phổ HMBC của CC1 119

Hình 3.43. Cấu trúc hóa học, tương tác 1H-1H COSY và HMBC (HC) chính của CC1 121

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [96]. Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái. Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng được ghi nhận [19, 222]. Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp như: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid… [48], [196]. Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide.

Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân. Trong đó mỗi đơn phân được cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid. COD được sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) [53]. COD là hoạt chất tự nhiên được tìm thấy ở vi khuẩn [55], nấm [168], thực vật [207], tảo [46], hải miên [17], và một số loại sinh vật biển khác [92, 141]. Trong các nhóm COD thì COD từ nấm ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất [196].

Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả năng gây độc ở thực vật [116], gây độc tế bào [176], kháng virus [93], diệt côn trùng [211], chống sốt rét [75], chống khối u [106], ức chế hoạt động của một số loại enzyme [128, 156] cũng như là hạn chế sự hình thành các amyloid ở bệnh Alzheimer [73]. Đặc biệt trong các nghiên cứu gần đây cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng có nhiều tiềm năng trong phòng chống ung thư, ức chế sự sinh trưởng của một số dòng ung thư khác nhau ở người [72, 107, 197]. Hiện nay, các hoạt chất COD từ nấm

ký sinh côn trùng được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên mới có tiềm năng ứng dụng trong y dược.

Trên thế giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng cũng như COD từ nấm ký sinh côn trùng bắt đầu từ khá sớm. Điển hình như nghiên cứu về tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var. enniatinum của Gaumann [57], nghiên cứu về sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, và D-L- Cyclodi- (β-seryloxy- propionyl) của Hassal và cộng sự [66] hay nghiên cứu về cấu trúc của beauvericin từ nấm của Hamill và cộng sự [64],... Trải qua hơn 70 năm, nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng vẫn thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và ứng dụng của chúng đã được công bố. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng hoặc sử dụng sinh khối nấm để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu như nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Lộc [3], Phạm Thị Thùy [10], Phạm Văn Nhạ [6],… Nghiên cứu về COD từ nấm ký sinh côn trùng là vấn đề rất mới mẻ, hiện chưa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam đề cập tới vấn đề này.

Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật ở miền Bắc Việt Nam. Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên vì thế hệ động thực vật ở hai khu vực này rất phong phú, không chỉ có giá trị nghiên cứu khoa học, bảo tồn nguồn gen mà còn có ý nghĩa trong phát triển kinh tế, khai thác tài nguyên thiên nhiên (đặc biệt là tài nguyên sinh vật). Với những khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở đây có rất nhiều loài động thực vật quý hiếm hiện hữu và đặc trưng cho vùng núi phía Bắc [2, 8, 223]. Tuy nhiên khu hệ nấm ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn còn chưa có nhiều nghiên cứu. Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế. Đặc biệt, hầu như không có nghiên cứu nào về nấm gây bệnh côn trùng ở hai khu vực này.

Nhằm bổ sung các hiểu biết về nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng cũng như góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học các loài nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn”.

2. Mục tiêu đề tài

Đánh giá được thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ).

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Nấm được phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ).

- Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp COD. Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường và điều kiện nuôi cấy thu nhận COD, tách chiết, tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học của COD từ chủng nấm đã tuyển chọn.

4. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

- Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide.

- Nghiên cứu định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử.

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy, sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm đã tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm.

- Nghiên cứu thu hồi, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide.

- Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các phân đoạn trong quá trình tách chiết cyclooligomer depsipeptide.

5. Những đóng góp mới của luận án

- Là luận án đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện (từ khâu phân lập, tuyển chọn, định loại, nghiên cứu các đặc điểm lên men thu nhận, tách chiết, tinh sạch, khảo sát hoạt tính sinh học của COD) về 01 chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả năng sinh tổng hợp COD và có tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

- Đây là luận án đầu tiên công bố về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và khả năng sinh tổng hợp COD của chủng nấm phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ).

- Lần đầu tiên ghi nhận sự có mặt của loài nấm Cordyceps cateniannulata tại Việt Nam.

- Là công bố đầu tiên trên thế giới về Cordyceps cateniannulata có khả năng sinh tổng hợp COD.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1. Nấm và nấm ký sinh côn trùng

1.1.1. Giới thiệu về nấm

Nấm là nhóm vi sinh vật nhân thật, đơn bào hoặc đa bào, dị dưỡng, dinh dưỡng hấp thu, có cơ thể dạng tản, vách tế bào có chứa chitin và ß- glucan. Nấm thường là vi sinh vật hiếu khí, sinh sản bằng bào tử (hữu tính và vô tính) [43]. Nấm rất đa dạng, ước tính có khoảng 1,5 tới 15 triệu loài, và hiện nay đã có gần 150 nghìn loài được phát hiện và miêu tả [23, 67]...

Mặc dù con người biết tới nấm, sử dụng nấm làm thực phẩm, rượu… nhưng cho tới năm 1969 nấm mới được xếp thành một giới riêng trong hệ thống 5 giới [200]. Hiện nay nấm được chia làm 5 ngành bao gồm nấm thích ty (Chytridiomycota), nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm mạch (Glomeromycota), nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm (Basidiomycota) [182]. Trong đó, gần 84 nghìn loài thuộc ngành Nấm túi, 50 nghìn loài ngành Nấm đảm [222].

Là một ngành sinh vật đa dạng, nấm đã và đang có nhiều tác động đến đời sống con người từ môi trường sinh thái, nông nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và y học. Nấm có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng, trong các mối quan hệ sinh thái, có khả năng phân hủy lignin, có khả năng cộng sinh giúp bảo vệ thực vật, động vật đồng thời một số ít có khả năng gây bệnh cho thực vật, động vật. Kháng sinh đầu tiên được phát hiện, tinh sạch, sản xuất thành dược phẩm là penicillin do Penicillium sinh ra. Từ đó đến nay, đã có hàng nghìn hoạt chất mới được phát hiện từ nấm. Nấm là nguồn sinh vật có tiềm năng cung cấp đa dạng các hoạt chất có thể ứng dụng trong đời sống con người [182].

1.1.2. Nấm ký sinh côn trùng

1.1.2.1. Sơ lược về nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [97]. Với đặc tính gây bệnh đặc thù cho các loài côn trùng khác nhau, nấm ký sinh côn trùng đã