2. KẾT QUẢ
- Đếm số plaque có trong mỗi giếng: các plaque là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở mặt đáy của các giếng.
- Dùng bút dạ đánh dấu và đếm các plaque rồi ghi số plaque đọc được ở trên nắp mỗi giếng.
- Tính kết quả trung bình của tất cả các giếng.
2.1.Tính kết quả
- Công thức tính:
Hiệu giá virus (PFU/ml) = a/b.c
Trong đó:
a: Số plaque trung bình;
Có thể bạn quan tâm!
-
Viện Công Nghệ Sinh Học (Ibt), Viện Hàn Lâm Kh&cn Việt Nam (Vast) -
Kiểm Tra Virus Ngoại Lai Trên Tế Bào Chứng Trong Sản Xuất Vắc Xin/sản Xuất Chủng -
Kiểm Tra Virus Ngoại Lai Trong Ngân Hàng Tế Bào (Mcb, Wcb) -
Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam - 22
Xem toàn bộ 178 trang tài liệu này.
b: Độ pha loãng;
c: số ml hỗn dịch virus cấy
- Ví dụ: ở độ pha 10-5: Giếng 1: 167 plaques
Giếng 2: 165 plaques
Số plaque trung bình: 166 plaque
Hiệu giá virus (PFU/ml) = 166 /(10-5x 0,2) = 8,3 x107 (PFU/ml)
2.2. Tiêu chuẩn chấp nhận
- Hiệu giá virus trong bán thành phẩm thô vắc xin VNNB ≥ 107 (PFU/ml).
- Hiệu giá virus trong chủng virus thử thách (CV) VNNB ≥ 105 (PFU/ml).
- Hiệu giá virus trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB ≥ 106(PFU/ml).
AN TOÀN CHUNG
a. Chuẩn bị mẫu thử
- Lấy đủ số lượng mẫu theo yêu cầu.
- Mẫu dạng dung dịch: Hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng.
- Mẫu dạng đông khô: Hoàn nguyên với dung dịch nước hồi chỉnh rồi hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng.
- Trường hợp mẫu cần pha loãng: Pha loãng mẫu về nồng độ yêu cầu rồi hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng.
b. Chuẩn bị chuột
- Chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm được cho ăn, uống đầy đủ trước tiêm.
- Chuột cần được kiểm tra trước khi tiêm để đảm bảo hoàn toàn bình thường.
- Cân, ghi trọng lượng và đánh dấu từng con (bằng phẩm mầu) ngay trước lúc tiêm vào biểu mẫu ghi chép.
c. Tiến hành tiêm
- Sát trùng vùng bụng động vật thí nghiệm bằng bông cồn.
- Tiêm vào phúc mạc từng chuột.
d. Liều tiêm
Nguyên tắc chung:
Tiêm phúc mạc chuột lang ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 5ml/con và tiêm phúc mạc chuột nhắt ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 1ml/con; Chuột chứng không tiêm - trừ một số vắc xin và sinh phẩm đặc biệt sẽ thực hiện theo chuyên luận riêng cho từng vắc xin, sinh phẩm.
e. Theo dõi động vật sau thí nghiệm
- Hàng ngày theo dõi, cân trọng lượng vào một giờ nhất định.
- Thời gian theo dõi: 7 - 14 ngày (tùy vắc xin, sinh phẩm).
f. Đánh giá kết quả
Thử nghiệm được coi là có giá trị khi tuân thủ đúng qui trình; Chuột chứng khỏe mạnh lên cân bình thường.
Tiêu chuẩn đánh giá kết quả
Vắc xin, sinh phẩm được coi là đạt yêu cầu nếu trong vòng 7 ngày theo dõi toàn bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và không có biểu hiện bệnh lý hoặc nhiễm độc (có trạng thái bất thường (*), giảm hoạt động, giảm cân hoặc chết do nhiễm độc).
(*): Trạng thái bất thường: Là các trạng thái, dấu hiệu bệnh lý không giống các mô tả đặc trưng (thường gặp) của vắc xin, sinh phẩm thử nghiệm.
Nếu nhóm chuột đối chứng khỏe mạnh lên cân bình thường, nhóm chuột tiêm vắc xin, sinh phẩm có ít nhất 1 chuột bị chết hay sút cân hoặc có biểu hiện bất thường trong quá trình theo dõi (7 ngày), phải tiến hành rà soát lại các yếu tố, điều kiện thử nghiệm kèm theo mổ chuột để xem tổn thương thực thể và lấy mẫu bệnh phẩmxác định nguyên nhân.
CHẤT GÂY SỐT
1. Nguyên vật liệu, điều kiện tiến hành
- Động vật thử nghiệm: lựa chọn thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái (không mang thai). Trọng lượng 1.5 – 2.5kg được nuôi dưỡng bằng thức ăn không chứa chất kháng sinh, không tụt cân trong suốt 1 tuần trước khi thử nghiệm và không có biểu hiện bệnh lý. Cho thỏ nhịn ăn nhưng uống nước đầy đủ trong thời gian ít nhất 18 giờ (qua 1đêm) và không cho uống nước trong thời gian làm thử nghiệm.
- Thử nghiệm được tiến hành trong phòng yên tĩnh, sạch sẽ, tránh mọi tiếng động và ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm và nhiệt độ phòng không chênh lệch quá 30C so với nơi ở cũ.
2. Quy trình thử nghiệm
- Thử nghiệm thăm dò: 3 ngày trước khi tiến hành tiêm sinh phẩm cần kiểm tra tính nhạy cảm cho các thỏ thử nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 10ml/ kg trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0.9% không chứa chất gây sốt đã được làm ấm lên khoảng 38.50C. Ghi nhiệt độ trước tiêm và tiếp tục trong vòng 3h sau tiêm dung dịch nước muối sinh lý. Nếu thỏ có nhiệt độ dao động >0.60C sẽ bị loại và không đưa vào thử nghiệm chính. Nhiệt độ dao động của mỗi thỏ là nhiệt độ tăng hoặc giảm sau tiêm so với nhiệt độ ban đầu.
- Thử nghiệm chính: thỏ thí nghiệm là thỏ đạt yêu cầu ở thử nghiệm thăm dò, được để trong lồng chuyên dụng ít nhất 60 phút để ổn định. Sau đó tiến hành đo nhiệt độ thỏ 2 lần mỗi lần cách nhau 30 phút (nếu đo tay) hoặc theo chương trình cài đặt (nếu đo bằng thiết bị). Nhiệt độ ban đầu của thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Tiêu chuẩn đưa thỏ vào thí nghiệm là những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo không quá 0.20C và nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 380C đến 39.80C. Mỗi mẫu thử được tiêm cho 1 nhóm gồm 3 thỏ và nhiệt độ chênh lệch trong nhóm không quá 10C
- Sau khi theo dõi, nhóm thỏ đạt yêu cầu sẽ được tiêm mẫu thử vào tĩnh mạch rìa tai thỏ. Thể tích được tiêm cho mỗi thỏ tương ứng với 1ml/kg cân nặng. Nên làm ấm dung dịch tới 38.50C trước khi tiêm. Đo nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian tùy thuộc vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay cứ 1giờ đo 1 lần, nếu dùng thiết bị tùy thuộc vào chương trình cài đặt).
- Nhiệt độ tối đa là nhiệt độ cao nhất đo trong khoảng thời gian này
3. Đánh giá thử nghiệm
- Đáp ứng của mỗi thỏ là hiệu số của nhiệt độ tối đa sau khi tiêm mẫu thử và nhiệt độ ban đầu.
- Đáp ứng của thỏ bằng 0 nếu nhiệt độ tối đa sau tiêm bằng hoặc thấp hơn nhiệt độ ban đầu.
- Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤ 0.60C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1.30C.
- Mẫu thử không đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ > 2.40C.
- Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn 1.30C đến 2.40C thì thử nghiệm phải tiến hành trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ ≤ 30C. Nếu > 4.10C coi như không đạt yêu cầu.
- Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn 30C đến 4.10C làm thêm lần cuối trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 9 thỏ ≤ 4.90C. Nếu > 4.90C coi như không đạt yêu cầu.
THỬ NGHIỆM CÔNG HIỆU
Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau khi tiêm miễn dịch trên chuột. Cụ thể: Huyết thanh sau tiêm được trung hòa với vi rút thử thách (CVS) sau đó gây nhiễm lên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác.
1.1. Nguyên vật liệu, dụng cụ
1.1.1. Nguyên vật liệu
- Môi trường pha loãng MEM 2% FBS (GIBCO/Sigma).
- Môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcellulose(GIBCO/Sigma).
- Dung dịch PBS 0,02% gelatin, pH 7,4.
- Dung dịch nhuộm cố định Crystal violet.
- Huyết thanh chứng dương (Vabioteach).
- Tế bào Vero hoặc BHK-21.
- Chủng vi rút viêm não Nhật Bản làm việc giữ ở -700C.
- Vắc xin chuẩn.
- Vắc xin Viêm não Nhật Bản thử nghiệm.
- Chuột trắng Swiss hoặc giống chuột phù hợp khác, 11-14g; khoẻ mạnh; 32 con (16 con cho vắc xin thử, 16 con cho vắc xin chuẩn) và 8 con làm chứng.
1.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị
- Phiến 24 giếng đáy bằng (Corning).
- Cốc thuỷ tinh to (Schott Duran): 1L & 2L.
- Giấy dán phiến.
- Pipet nhựa vô trùng loại 10ml, 25 ml (Corning).
- Tuýp nhựa 15 ml, 50 ml, tuýp eppendorf.
- Bơm tiêm nhựa vô trùng 3ml (Việt Nam).
- Pipet-aid, pipet-man loại 20 µl, 200µl, 1000µl (Eppendorf).
- Chai lọ thuỷ tinh (Schott Duran) loại 50ml, 500ml, 1000ml vô trùng.
- Hốt Laminar (Nuare ClassII)
- Tủ ấm CO2(Sanyo-2172)
- Bể ổn nhiệt(CHCL-Lab, No0301299)
- Máy ly tâm lạnh (Marathol 2100R)
- Kính hiển vi phản pha.(Olympus-CK2)
- Máy lắc (IKA).
1.2. Các bước tiến hành
1.2.1. Pha vắc xin gây miễn dịch
- Pha vắc xin chuẩn và vắc xin mẫu thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32.
- Vắc xin đã pha phải bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC.
1.2.2. Tiêm miễn dịch
- Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột gồm 16 con, mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm nhựa vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày.
- Một nhóm 8 chuột không tiêm dùng làm chứng âm.
1.2.3. Lấy máu chuột, tách huyết thanh
- 7 ngày sau khi tiêm mũi thứ 2, toàn bộ chuột được lấy máu tim riêng rẽ. Máu được chứa trong các tuýp eppendorf.
- Ủ các tuýp máu ở 37oC / 60 phút.
- Để ở tủ lạnh 4oC qua đêm.
- Ly tâm các mẫu máu ở 3000 vòng/ phút x 30 phút ở nhiệt độ 4oC.
- Chắt lấy huyết thanh sang tuýp eppendorf mới, lượng huyết thanh cần lấy ở mỗi tuýp là 200µl.
- Huyết thanh chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp, sau đó chúng được hộn chung vào tuýp và ký hiệu RA và RB.
- Huyết thanh thử được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp sau đó chúng được hộn chung vào tuýp ký hiệu VA và VB.
- Huyết thanh của 8 chuột chứng được hộn chung thành 1 týp ký hiệu là CA (-).
- Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút.
- Bảo quản ở - 20 oC cho đến khi làm thử nghiệm trung hoà.
1.2.4. Pha loãng huyết thanh
- Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha loãng trong môi trường MEM 2% FBS để có 3 độ pha là 1/80 1/160 và 1/320.
- Pha huyết thanh chứng dương để có độ pha loãng 1/80 và 1/160.
- Pha huyết thanh chứng âm để có độ pha loãng pha 1/10.
- Pha loãng huyết thanh chứng âm 1/10:0,5 ml huyết thanh + 4,5 ml MEM 2%FBS.
1.2.5. Pha chủng vi rút viêm não thử thách có hiệu giá là: 100- 200PFU/ 200µl Ký hiệu chủng ở độ pha này là: CV.
1.2.6. Trung hoà huyết thanh và vi rút
- Lấy 1 ml của mỗi độ pha huyết thanh được chuẩn bị tại mục 5.3.4 trộn với 1 ml chủng CV; 2 ml chủng CV trộn với 2 ml MEM 2% FBS.
- Đặt vào bể ổn nhiệt 37oC / 90 phút.
- Lấy ra, làm lạnh trong nước đá.
1.2.7. Gây nhiễm trên tế bào Vero hoặc BHK-21
- Tế bào đã được nuôi cấy 1 lớp trong phiến 6 giếng.
- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng sao cho còn khoảng 0,5 ml/giếng.
- Đánh dấu các độ pha trên các giếng.
- Nhỏ 200µl hỗn dịch (huyết thanh + vi rút) vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ cấy 2 giếng; Hỗn dịch CV- MEM 2% FBS nhỏ 10 giếng.
- Để phiến trong tủ ấm 37OC, 5%CO2 trong 90 phút để vi rút tiếp xúc với tế bào.
1.2.8. Phủ thạch
- Cho vào mỗi giếng 3 ml môi trường thạch MEM 1% Methylcellulose.
- Ủ 37oC/5%CO2 trong 4-5 ngày.
1.2.9. Cố định và nhuộm tế bào
- Ngày thứ 5 hút hết môi trường trong giếng.
- Cho vào mỗi giếng 1 ml dung dịch nhuộm.
- Để phiến ở nhiệt độ phòng 15-20 phút.
- Rửa phiến dưới vòi nước.
- Đếm plaque bằng mắt thường.
1.2.10. Đọc và tính kết quả
Theo phần mềm hoặc công thức tính hiệu giá kháng thể trung hoà:
* Tỉ lệ giảm đám hoại tử được tính theo công thức:
S: số plaque trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh pha. CV số plaque trung bình của CV/giếng.
* Hiệu giá kháng thể trung hoà được tính theo công thức sau:
Z: logarit của hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử của thử nghiệm.
x: số nghịch đảo của độ pha loãng.