Kiểm Tra Virus Ngoại Lai Trong Ngân Hàng Tế Bào (Mcb, Wcb)

Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml mẫu thử /chai.

- Cho 9 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào mỗi chai.

3.1.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy

- Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.

- Thời gian nuôi cấy 14 ngày.

- Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14.

1.2. Kiểm tra virus ngoại lai trong ngân hàng tế bào (MCB, WCB)

1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

- 10 ống tế bào MBC, WBC được lấy ra từ nitrogen lỏng, nuôi cấy. Sau 2-7 ngày tế bào kín một lớp, quan sát không thấy có CPE, hộn nước nổi trong các chai tế bào, tiến hành kiểm tra virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu .

- Số lượng chai tế bào: 10 chai tế bào.

1.2.2. Kiểm tra virus ngoại lai trên các dòng tế bào (thực hiện như mục 3.1.2)

1.3. Kiểm tra virus ngoại lai trong chủng virus (MSV, WSV)

1.3.1. Xử lý mẫu

- Trung hòa chủng virus với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiến hành thử nghiệm kiểm tra VRNL.

- Pha loãng huyết thanh bằng Hank’s ở độ pha thích hợp để trung hòa hết được với hỗn dịch virus.

- Xử lý mẫu: Mẫu chứng: Trộn đều kháng huyết thanh với Hank’s theo tỉ lệ 1:1 Mẫu thử: Trộn đều chủng virus với kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1:1.

- Ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 60 - 90 phút tùy thuộc vào phản ứng

trung hòa của từng loại virus.

1.3.2. Kiểm tra virus ngoại lai gây CPE trong chủng virus trên tế bào

3.3.2.1. Chuẩn bị tế bào (thực hiện như mục 3.1.2).

3.3.2.2. Pha môi trường duy trì tế bào (MEM 2% FBS) thực hiện như mục 3.1.2.2)

3.3.2.3. Nuôi cấy trên tế bào:

- Rửa tế bào trong dung dịch Hank’s: cho 3ml Hank’s vào mỗi chai, láng đều bề mặt tế bào, hút bỏ Hank’s.

- Nuôi cấy trên tế bào:

Mẫu chứng (1 chai tế bào): 3 ml (KHT + Hank’s)/chai.

Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml hỗn dịch chủng sau khi trung hòa/chai.

- Hấp phụ: 2 giờ trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.

- Hút bỏ nước nổi trong các chai, cho 09 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào mỗi chai.

3.3.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy

- Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.

- Thời gian nuôi cấy 14 ngày.

- Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14.

1.3.3. Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu

+ Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên tế bào đã gây nhiễm.

- Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào sau 14 ngày theo dõi.

- Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên các chai tế bào

2. KẾT QUẢ

2.1. Giá trị của thử nghiệm

- Ít nhất 80% số chai tế bào của mẫu thử duy trì cho đến khi kết thúc thời gian quan sát.

2.2. Đọc kết quả

- Kết quả dương tính (+), có virus ngoại lai: tế bào bị huỷ hoại, quan sát được CPE hoặc virus hấp phụ hồng cầu.

- Kết quả âm tính (-), không có virus ngoại lai: tế bào không bị huỷ hoại và không có virus hấp phụ hồng cầu.

2.3. Tiêu chuẩn chấp thuận

- Không có hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào và không có virus hấp phụ hồng cầu.

KIỂM TRA VI RÚT NGOẠI LAI TRÊN ĐỘNG VẬT

1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.1. Chuẩn bị mẫu thử

- Tùy thuộc vào từng loại chủng virus, nếu cần sẽ tiến hành trung hòa chủng virus với kháng huyết thanh.

- Chủng virus được trung hòa với kháng huyết thanh ở độ pha loãng phù hợp theo tỉ lệ 1:1

- Ủ trong bình ổn nhiệt 370C/90 phút.

1.2. Kiểm tra trên chuột ổ

Số lượng mẫu thử: 3ml

Số lượng chuột/ ổ: 10con/ ổ

Độ tuổi: 1 ngày tuổi

Số lượng chuột kiểm tra: 20 con/ đường tiêm não 20 con/ đường tiêm phúc mạc

10 con/ nhóm chứng

Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,01ml/con

Đường tiêm phúc mạc: 0,1ml/con Nhóm chứng: không tiêm

Theo dõi chuột:

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.

- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14.

1.3. Kiểm tra trên chuột nhắt trưởng thành

Số lượng mẫu thử: 7ml

Trọng lượng chuột: 15-20 gram/con

Số lượng chuột kiểm tra: 10 con/ đường tiêm não 10 con/ đường tiêm phúc mạc

10 con/ nhóm chứng

Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,03ml/con

Đường tiêm phúc mạc: 0,5ml/con Nhóm chứng không tiêm

Theo dõi chuột:

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 21 ngày.

- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21.

1.4. Kiểm tra trên chuột lang

Số lương mẫu: 28ml

Trọng lượng chuột: 350-450 gram/con

Số lượng chuột kiểm tra: 5 con/ đường tiêm phúc mạc

5 con/ nhóm chứng

Liều tiêm: Đường tiêm phúc mạc: 5ml/con Nhóm chứng không tiêm

Theo dõi chuột:

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 42 ngày.

- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24, 28, 32, 35, 38, 42.

1.5. Trên thỏ trưởng thành (chỉ áp dụng đối với chủng virus được sản xuất từ tế bào thận khỉ tiên phát)

Số lượng mẫu: 20 ml

Trọng lượng: 1,8 - 2,5 kg/con

Số lượng thỏ kiểm tra: 5 con/ đường tiêm dưới da

5 con / đường tiêm trong da 2 con/ nhóm chứng

Liều tiêm: Đường tiêm dưới da: 2ml/con Đường tiêm trong da: 1ml/con

Nhóm chứng: không tiêm

Theo thỏ sau tiêm:

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệmlà 30 ngày.

- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24, 28, 30.

1.6. Trên trứng gà có phôi(chỉ áp dụng đối với ngân hàng tế báo gốc, ngân hàng tế bào sản xuất)

Số lượng mẫu: 4ml

Độ tuổi phôi trứng gà: 9-11 ngày tuổi

Số lượng trứng gà có phôi kiểm tra: 10 quả/ đường tiêm túi noãn

5 quả/ nhóm chứng

Liều tiêm: Đường tiêm túi noãn: 0,2ml/quả Nhóm chứng không tiêm

Theo dõi trứng gà sau gây nhiễm:

- Thời gian theo dõi là 5 ngày.

- Ghi nhật ký tình trạng sống/chết của phôi trứng gà hàng ngày.

- Sau 5 ngày theo dõi tiến hành lấy dịch niệu kiểm tra ngưng kết hồng cầu với hồng cầu gà..

2. KẾT QUẢ

2.1. Đọc kết quả

- Trên chuột ổ: đọc kết quả vào ngày 14.

- Trên chuột nhắt trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 21.

- Trên chuột lang: đọc kết quả vào ngày 42.

- Trên thỏ trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 30.

- Trên trứng gà có phôi: đọc kết quả vào ngày 5.

2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận

Trên chuột ổ: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.

Trên chuột nhắt trưởng thành: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.

Trên chuột lang:

- ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.

- Các cơ quan nội tạng không có dấu hiệu bất thường.

Trên thỏ trưởng thành:

- ≥ 80% thỏ sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.

Trên trứng gà có phôi:

- ≥80% phôi trứng gà sống khoẻ mạnh. Dịch niệu: không có ngưng kết với hồng cầu gà

HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN CHUỘT

1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.1. Chuẩn bị động vật thí nghiệm

+ Chuột được chuẩn bị trước ngày gây nhiễm 2 ngày và được chọn ngẫu nhiên với số lượng:

- 10 con cho mỗi độ pha loãng x 5 độ pha

+ Chuột được đánh dấu và ghi nhãn mỗi lồng theo từng loại, từng độ pha loãng. Nhãn cho mỗi lồng chuột bao gồm các thông tin sau: tên sản phẩm, loạt số, màu đánh dấu chuột, ngày tiêm và ngày kết thúc thử nghiệm.

1.2. Pha loãng chủng vi rút

Pha loãng mẫu thử bậc 10 bằng dung dịch pha loãng như sau:

Tuýp số

Độ pha loãng

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

Mẫu thử (ml)

D2pha loãng (ml)

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

0,2

1,8

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 178 trang tài liệu này.

1.3. Tiêm chuột

- Sử dụng các độ pha từ 10-5 đến 10-9 để tiêm chuột

- Sát trùng vị trí tiêm. Dùng bơm tiêm 1ml lấy hỗn dịch vi rut đã pha loãng ở trên.

- Liều tiêm: 0,03ml/1chuột.

- Đường tiêm: Não.

- Thay bơm tiêm khi tiêm với độ pha mới.

1.4. Theo dõi chuột

- Theo dõi các dấu hiệu chuột bị nhiễm vi rút VNNB: liệt 1-2 chân trước; liệt 1-2 chân sau, liệt 1 chân trước 1 chân sau hoặc chết do bị liệt chân.

- Thời gian theo dõi súc vật thí nghiệm là 14 ngày.

- Theo dõi tình trạng nhiễm vi rút VNNB của chuột bắt đầu từ sau tiêm 3 ngày và ghi nhật ký tình trạng chuột hàng ngày trong thời gian theo dõi 14 ngày.

2. KẾT QUẢ

2.1 Tính kết quả: Tính kết quả theo công thức Reed and Muench

Lg LD50 = Lg A - k x

50 - a
	b - a

Trong đó: A: Độ pha loãng gây chết sát trên 50% tổng số chuột a: % số chuột chết sát dưới 50%

b: % số chuột chết sát trên 50% k: log của độ pha loãng

2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận

Hiệu giá vi rút trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB≥10-6.0

HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN TẾ BÀO

1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.1 Pha loãng mẫu thử

- Pha loãng mẫu thử bậc 10 trong tuýp Eppendorf, ví dụ như sau:

Tuýp số

Độ pha loãng

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

Mẫu thử (ml)

Dung dịch LE+BA

(ml)

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

0,1

0,9

1.2 Gây nhiễm trên tế bào

+ Gây nhiễm trên phiến tế bào 6 giếng:

- Đánh dấu các độ pha trên các giếng.

- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong giếng.

- Cấy 200 l hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên (03 độ pha cuối) vào mỗi giếng, mỗi độ pha 2 giếng.

+ Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút. Cứ 30 phút láng 1 lần.

1.3 Phủ thạch và nhuộm cố định tế bào

1.3.1 Phủ thạch

- Cho 3 ml môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcelluse vào mỗi giếng.

- Ủ các phiến 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2).

1.3.2 Cố định và nhuộm tế bào

- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng.

- Cho 0,5 ml dung dịch nhuộm cố định vào và ủ 30 - 45 phút ở nhiệt độ phòng 20 – 25oC.

- Rửa phiến dưới vòi nước chảy. Để khô và đọc kết quả.