Bảng 3.17. Kết quả đánh giá cảm quan, tỷ trọng và vô trùng của 10 lô vắc xin JECEVAX
Cảm quan | Tỷ trọng (thể tích) | Vô trùng | ||||
N | % đạt | N | g/ml | N | % đạt | |
J-VC0110 | 3 | 100 | 3 | 1,12 | 20 | 100 |
J-VC0210 | 3 | 100 | 3 | 1,13 | 20 | 100 |
J-VC0310 | 3 | 100 | 3 | 1,13 | 20 | 100 |
J-VC010313 | 3 | 100 | 3 | 1,14 | 20 | 100 |
J-VC020713 | 3 | 100 | 3 | 1,13 | 20 | 100 |
J-VC030713 | 3 | 100 | 3 | 1,13 | 20 | 100 |
J-VC040713 | 3 | 100 | 3 | 1,12 | 20 | 100 |
J-VC031114 | 3 | 100 | 3 | 1,14 | 20 | 100 |
J-VC010416 | 3 | 100 | 3 | 1,13 | 20 | 100 |
J-VC010818 | 3 | 100 | 3 | 1,12 | 20 | 100 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Thông Tin Về Trình Tự Vùng Gen E Của Các Chủng Vi Rút Vnnb Phân Lập Ở Việt Nam Trong Các Năm Khác Nhau Và Từ Các Vật Chủ Khác Nhau Sử Dụng Trong -
Tính Ổn Định Về Hiệu Giá Và Di Truyền Của Chủng Beijing-1 -
Tính Ổn Định Hiệu Giá Chủng Gốcbv-Msv-0210 Và Chủng Sản Xuất Bv- Wsv-0310 Khi Bảo Quản Trong Nitrogen Lỏng -
Sự Tương Đồng Kháng Nguyên Của Chủng Sản Xuất Vắc Xin Vnnb So Với Các Chủng Viêm Não Nhật Bản Lưu Hành Tại Việt Nam -
Tính An Toàn Và Tính Sinh Miễn Dịch Của Jecevax Sản Xuất Từ Chủng Bv- Wsv-0310 Ở Quy Mô Phòng Thí Nghiệm -
Xây Dựng Tiêu Chuẩn Chất Lượng Của Chủng Để Sản Xuất Vắc Xin Vnnb Bất Hoạt Trên Tế Bào Vero (Jecevax)
Xem toàn bộ 178 trang tài liệu này.
Bảng 3.18. Kết quả kiểm định các chỉ số hóa học của 10 lô vắc xin JECEVAX
Thimerosal (µg/ml) | Formaldehyde (µg/ml) | Protein TS(µg/ml) | DNA tồn dư (ng/ml) | pH | |
Tiêu chuẩn (WHO TRS 963) | ≤ 120 µg/ml | ≤ 10 µg/ml | ≤ 80 µg/ml | ≤ 10 ng/ml | 6,8-7,4 |
J-VC0110 | 53,3 | 0,34 | 9,89 | < 5 | 7,061 |
J-VC0210 | 49,3 | 0,71 | 6,3 | < 5 | 7,079 |
J-VC0310 | 48,7 | 0,22 | 5,35 | < 5 | 6,967 |
J-VC010313 | 47,0 | 0,086 | 10,43 | < 5 | 7,078 |
J-VC020713 | 49,0 | 0,11 | 3,16 | < 5 | 7,109 |
J-VC030713 | 49,0 | 0,14 | 5,63 | < 5 | 7,11 |
J-VC040713 | 48,0 | 0,1 | 9,26 | < 5 | 7,113 |
J-VC031114 | 52,0 | 0,27 | 8,46 | < 5 | 7,045 |
J-VC010416 | 45,7 | 0,27 | 4,43 | < 5 | 7,016 |
J-VC010818 | 50,1 | 0,57 | 8,18 | < 5 | 7,023 |
Các chỉ số lý- hóa học, cảm quan, vô trùng của 10 lô vắc xin JECEVAXđều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn của TCYTTG (WHO TRS 963).
3.1.2.3. Kết quả tính sinh miễn dịch của vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAXtrên động vật thí nghiệm
Bảng 3.19. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch (công hiệu/hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKTTH)) của các lô vắc xin JECEVAX trên động vật thực nghiệm
HGKTTH của vắc xin thử (log10n) | HGKTTH của vắc xin chuẩn BR209 (log10n) | Công hiệu tương quan (mẫu thử/mẫu chuẩn BR209) | HG VR (log FPU/ml) | Năm sản xuất | |
Phương pháp | DĐVN IV, 2009, WHO TRS 963 | ||||
J-VC0110 | 2,359 | 2,304 | 1,024 | 7,59 | 2010 |
J-VC0210 | 1,907 | 1,772 | 1,076 | ||
J-VC0310 | 2,260 | 2,196 | 1,029 | ||
J-VC010313 | 2,053 | 1,910 | 1,075 | 7,57 | 2013 |
J-VC020713 | 1,729 | 1,678 | 1,030 | ||
J-VC030713 | 1,700 | 1,678 | 1,013 | ||
J-VC040713 | 1,713 | 1,678 | 1,021 | ||
J-VC031114 | 1,772 | 1,689 | 1,049 | 7,57 | 2014 |
J-VC010416 | 1,867 | 1,629 | 1,146 | 7,58 | 2016 |
J-VC010818 | 2,069 | 1,875 | 1,103 | 7,54 | 2018 |
Trung bình | 1,943 | 1,841 | 1,057 | 7,57 | / |
Công hiệu vắc xin được tính bằng chỉ số trung hòa log10n, n là kết quả định lượng kháng thể trung hòa bằng kỹ thuật trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50). Hiệu giá kháng thể trung hòa của 10 lô vắc xin JECEVAX đều cao hơn hiệu giá trung hòa của vắc xin mẫu chuẩn (giới hạn tối thiểu cho phép của thử nghiệm HGKTTHtham chiếu theo vắc xin JE-CEVAX (Biken) là ≥ 1,3 log) (bảng 3.19).
10/10 loạt vắc xin có hiệu giá kháng thể trung hòa tương quan mẫu thử/mẫu chuẩn BR209 đều >1. Đạt yêu cầu của TCYTTG (mẫu vắc xin ≥ mẫu chuẩn).
Kết quả hiệu giá kháng thể trung hòa của vắc xin
JECEVAX và VX mẫu chuẩn BR209
2,500
2,000
1,500
1,000
500
0
CEJEVAX
BR209
Lô vắc xin JECEVAX
Hiệu giá kháng thể
trung hòa (log PRNT50)
Hình 3. 8. Hiệu giá kháng thể trung hòa của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu chuẩn BR209
Kết quả công hiệu tương quan của vắc xin JECEVAX so
1,200
1,150
1,100
1,050
1,000
950
900
với tiêu chuẩn (>=1,0)
công hiệu
tương quan của vắc xin JECEVAX
Tiêu chuẩn công hiệu
tương quan
Lô vắc xin JECEVAX
Công hiệu tương quan
Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm (công hiệu) của 10 lô vắc xin VNNB JECEVAXcho thấy đều cao hơn vắc xin mẫu chuẩn BR209, HGKTTH của JECEVAX đạt được từ 1,7 – 2,36 log so với tiêu chuẩn cơ sở> 1,3 log (hình 3.8 và bảng 3.19).
Hình 3. 9. Công hiệu tương quan của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu chuẩn BR209
Kết quả nghiên cứu tại hình 3.9 cho thấy công hiệu tương quan của 10 lô vắc xin JECEVAXso với vắc xin mẫu chuẩn BR209 đều >1,0 và dao động trong khoảng 1,013 – 1,146.
Từ kết quả nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm cho thấy chất lượng chủng BV-WSV-0310 và vắc xin sản xuất từ chủng Beijing-1 này đều đáp ứng các yêu cầu
của TCYTTG (WHO TRS 963) đưa ra. Đó là cơ sở khoa học để thuyết phục nhà nước cấp kinh phí cho thử nghiệm trên người ở quy mô lâm sàng 3 giai đoạn theo hướng dẫn của TCYTTG.
3.1.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam
Bảng 3.20. Kết quả nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam
Tên thử nghiệm | Phương pháp | Tiêu chuẩn của TCYTTG | Xây dựng TCCS | Áp dụng | |
1 | Thử nghiệm vô trùng | Cấy trực tiếp trên môi trường Thioglycholate và soybean casein | Đạt vô trùng | Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên 2 loại môi trường sau 14 ngày nuôi cấy | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin |
2 | Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma | Nuôi cấy trực tiếp trên môi trường thạch PPLO | Không phát hiện Mycoplasma | Không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin (nếu cần) |
3 | Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột nhắt | Tiêm vào não và phúc mạc, theo dõi trong 21 ngày | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin (nếu cần) |
4 | Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột ổ | Tiêm vào não và phúc mạc, theo dõi trong 14 ngày | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin (nếu cần) |
5 | Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột lang | Tiêm vào phúc mạc, theo dõi trong 42 ngày | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, các cơ quan nội tạng chuột bình thường, không có dấu hiệu bệnh lý | Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh, các cơ quan nội tạng chuột bình thường, không có dấu hiệu bệnh lý | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin (nếu cần) |
Kiểm tra vi rút ngoại lai của chủng trên tế bào | Gây nhiễm hỗn dịch vi rút đã trung hòa với huyết thanh kháng vi rút VNNB Beijing-1 trên tế bào Vero, MRC5, BHK21 sau 14 ngày bỏ dịch nổi kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu | Không có hủy hoại tế bào (CPE) và không có vi rút hấp phụ hồng trong các chai tế bào gây nhiễm mẫu thử, không có vi rút ngưng kết hồng cầu trong mẫu thử | Không có hủy hoại tế bào (CPE) và không có vi rút hấp phụ hồng trong các chai tế bào gây nhiễm mẫu thử, không có vi rút ngưng kết hồng cầu trong mẫu thử | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin (nếu cần) | |
7 | Nhận dạng | ELISA | Không đưa ra | Mẫu chứa kháng nguyên vi rút VNNB(OD có màu vàng) | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin |
8 | Nhận dạng | PCR (GTTG) | Không đưa ra | % tương đồng gen E ≥ 95% so với chủng chuẩn | Áp dụng trong đăng ký chủng hoặc kiểm định thường quy |
9 | Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào BHK21/Ver o | Tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21/ Vero | Không đưa ra | ≥ 6 log PFU/ml (hoặc ≥ 106 PFU/ml) | Áp dụng trong đăng ký chủng và kiểm định thường quy chủng trước và trong sản xuất vắc xin |
Bảng 3.21. Xây dựng tiêu chuẩn về số đời cấy chuyển, tế bào cấy chuyển và nhiệt độ bảo quản chủng gốc và chủng sản xuất
Tiêu chuẩncơ sở | Khuyến nghị | ||
Chủng gốc | Chủng sản xuất | ||
1 | Số đời cấy chuyển | - Tối đa 6 đời, tính các đời cấy chuyển tại Việt Nam - Tối đa 47 đời, tính theo Hồ sơ chủng từ nhà sản xuất (NIH, Nhật Bản) | - Tối đa 7 đời, tính các đời cấy chuyển tại Việt Nam - Tối đa 48 đời, tính theo Hồ sơ chủng từ nhà sản xuất (NIH, Nhật Bản) |
2 | Loại tế bào cấy chuyển | Loại tế bào: Vero | |
Số đời tế bào: Tối đa 150 | |||
3 | Điều kiện bảo quản | Ưu tiên các điều kiện bảo quản theo thứ tự: - Nitrogen lỏng - - 20oC/3 tháng - 2-8oC/3 ngày | |
Bảng 3.22. Xây dựng tiêu chuẩn về tính ổn định di truyền và hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất
Tiêu chuẩncơ sở | Khuyến nghị | |
1 | Ổn định về mặt di truyền | Trình tự nucleotide kháng nguyên E tương đồng với mẫu chuẩn Reference JEV Beijing-Kanonji (≥95%) |
Trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E tương đồng với mẫu chuẩn Reference JEV Beijing-Kanonji (≥95%) | ||
Trình tự nucleotide kháng nguyên E tương đồng với các chủng Vi rút Viêm não Nhật Bản phân lập được tại Việt Nam (≥85%) | ||
Trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E tương đồng với các chủng Vi rút Viêm não Nhật Bản phân lập được tại Việt Nam (≥85%) | ||
2 | Ổn định về hiệu giá | Hiệu giá vi rút duy trì ≥ 6,0 logPFU/ml (hay ≥ 106PFU/ml) |
Từ kết quả nuôi cấy và sản xuất lô chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310 của vi rút VNNB từ khi thiết lập đến thời điểm nghiên cứu, tiêu chuẩn khuyến nghị cho số đời cấy tối đa của chủng gốc là 6 đời và chủng sản xuất là 7 đời. Loại tế bào sử dụng cho nuôi cấy vi rút VNNB là tế bào Vero với số đời cấy chuyển tối đa là 150 đời. Chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV- 0310 sẽ giảm dần hiệu giá vi rút khi được bảo quản theo thời gian. Các điều kiện bảo quản ưu tiên lần lượt là nitrogen lỏng, - 60oC/3 tháng và - 20oC/3 ngày (bảng 3.21).
3.2. Bàn luận
3.2.1. Tính ổn định về hiệu giá, di truyền của chủng vi rút Viêm não Nhật Bản sau sản xuất và điều kiện bảo quản
Lịch sử phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản đã trải qua nhiều giai đoạn với các công nghệ kỹ thuật sản xuất khác nhau như vắc xin bất hoạt nuôi cấy từ não chuột, vắc xin bất hoạt nuôi cấy trên tế bào vero, vắc xin sống giảm độc lực nuôi cấy trên tế bào Vero [4, 25, 33]. Dù sử dụng công nghệ nào trong sản xuất thì chất lượng chủng vi rút sử dụng trong sản xuất cũng là yếu tố quyết định đảm bảo chất lượng vắc xin, đặc biệt khả năng sinh miễn dịch bảo vệ cơ thể[5]. Dựa trên tình hình dịch tễ học lưu hành của bệnh, chủng vi rút VNNB được lựa chọn, phân lập và sản xuất thành
các lô chủng vi rút thuần khiết, đáp ứng đầy đủ điều kiện làm chủng vắc xin, bảo quản lâu dài để phục vụ cho sản xuất vắc xin. Các lô chủng vi rút chuẩn gốc được TCYTTG cho phép phân phối tới các nước và/hoặc các nhà sản xuất. Tại đây, chủng vi rút gốc(MSV)và chủng vi rút sản xuất(WSV)tiếp tục được cấy chuyển qua nhiều đời và bảo quản trong các điều kiện phù hợp như nitrogen lỏng để phục vụ quy trình sản xuất vắc xin trong thời gian dài. Quá trình bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau có những nguy cơ nhất định ảnh hưởng đến tính ổn định về hiệu giá, di truyền của chủng vi rút [5, 51]. Do vậy, trong quá trình bảo quản chủng sau sản xuất, chủng cần được định kỳ kiểm tra các yếu tố về hiệu giá vi rút, di truyền và một số tính chất có ảnh hưởng đến chất lượng của chủng sử dụng trong sản xuất vắc xin.
Đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá một cách tổng thể và hệ thống chất lượng chủng gốc và chủng sản xuất sử dụng trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chủng gốc (BV-MSV-0210)và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) của vi rút VNNB được cấy chuyển từ chủng chuẩn Beijing- 1 Kanonji. Sau sản xuất, ngân hàng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) được bảo quản trong nitrogen lỏng để sản xuất vắc xin VNNB JECEVAX. Kiểm định nhận dạng là một trong thử nghiệm không thể thiếu khi đánh giá chất lượng chủng sau sản xuất và trong quá trình bảo quản. Ngay sau sản xuất, thử nghiệm này cũng được triển khai song song các lô chủng như lô chủng gốcBV- MSV-0210và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 và được so sánh với chủng chuẩn gốc (P0) (Reference JEV Beijing-1) do Kanonji, Nhật Bản cung cấp, là chủng dùng để sản xuất ra 2 lô chủng sử dụng trong nghiên cứu. RNA tổng số được tách chiết và tinh chế từ mỗi mẫu,sử dụng kítQIAamp Viral RNA Mini (Qiagen). Chất lượng của thư viện DNA sợi đôi được kiểm tra bằng thiết bị Bioanalyzer sử dụng High Sensitivity Chip (Agilent Technologies). Kết quả ở tất cả các lượt kiểm tra cho thấy trình tự nucleotide và trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của 2 chủng này có sự tương đồng 100% và so với chủng chuẩn tham chiếu Beijing-1 Kanonji cũng tương đồng 100%.Với kết quả này bước đầu có thể khẳng định các lô chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin VNNB của Vabiotech qua 7 đời cấy chuyển vẫn ổn định không bị biến đổi. Kết quả này cũng khẳng định quy trình sản xuất cũng như bảo quản trong nghiên cứu này đảm bảo được chất lượng của các lô chủng gốc và
chủng sản xuất. Xác nhận các điều kiện về dòng tế bào, đời tế bào nuôi cấy, trang thiết bị, môi trường tại Việt Nam đáp ứng được yêu cầu sản xuất chủng gốc và chủng sản xuất cho vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero.
Tính ổn định về hiệu giá vi rút
Các ống chủng của lô chủng gốc BV-MSV-0210và lô chủng sản xuất BV- WSV-0310 cũng được kiểm định hiệu giá vi rút ngay sau khi sản xuất và định kỳ trong suốt 10 năm bảo quản chủng sau sản xuất. Có nhiều phương pháp kiểm định hiệu giá vi rút, nghiên cứu này của chúng tôi áp dụng hai phương pháp phổ biến được áp dụng trong nhiều nghiên cứu về sản xuất vắc xin VNNB đó là phương pháp chuẩn độ hiệu giá LD50trên chuộtvà phương pháp tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào [9, 10, 25]. Đây là hai phương pháp đã được phát triển và hoàn thiện tại Việt Nam trong quá trình hoàn thiện công nghệ sản xuất và kiểm định vắc xin. Đối với phương pháp chuẩn độ hiệu giá LD50 trên chuột, chủng pha loãng từ 10-5 đến 10-8 sẽ được gây nhiễm trên não chuột nhắt trắng 11-13 g, 0,03ml/não x 10 chuột/độ pha.Nuôi& theo dõi trong 14 ngày, đọc và ghi số chuột chết từ ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng. Tính kết quả LD50 theo công thức Reed-Muench. Theo dõi quan sát thấy các dấu hiệu đặc trưng về thần kinh của chuột sau gây nhiễm với chủng vi rút VNNB như xù lông, 1 số con còn có biểu hiện bại hông, chân đi hơi lết nhẹ từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 4. Sang ngày thứ 5 thì còn kèm thêm các triệu chứng mù lòa mắt và liệt 2 chân sau duỗi ra ngày càng nặng hơn ở các độ pha 10-5, các chuột ở độ pha loãng hơn thì các biểu hiện trên chậm hơn. Và từ ngày thứ 6 trở đi chuột bắt đầu bị chết nhiều. Từ ngày thứ 11 đến ngày thứ 14 gần như không có con nào chết nhưng so với chuột chứng không tiêm thì nó gầy, sút cân hơn. Các hiện tượng được quan sát và mô tả trong nghiên cứu này cũng phù hợp với các phương pháp kiểm định này tại Việt Nam và trên thế giới [61]. Phương pháp này được gọi là phương pháp thử thách trực tiếp trên chuột thí nghiệm được T. Muira mô tả lần đầu trong kết quả phương pháp kiểm nghiệm công bố năm 1970[61, 62]. Như vậy có thể khẳng định thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá bằng phương pháp LD50 trên chuột Swiss tại Việt Nam hiện nay phù hợp để áp dụng vào kiểm định thường quy cho vắc xin này.
Một phương pháp khác cũng được áp dụng trong kiểm định hiệu giá vi rút VNNB đó là phương pháp tạo đám hoại tử trên tế bào Vero và/hoặc BHK-21 (PFU).