Ảnh Hưởng Của Giá Thể Lên Khả Năng Tái Sinh Chồi Từ Ttcl-L Giống

của thân (vị trí đốt thân thứ 3 và 4) tăng trưởng mạnh mẽ hơn so với những vị trí đốt thân gần nhất với đỉnh sinh trưởng (vị trí đốt thân 1 và 2) [100]. Chattopadhyaya và cs (2010) cũng nhận định rằng, tuổi của mẫu là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh chồi vì mẫu non hơn hoặc già hơn 4-6 tuần tuổi có tần suất tái sinh chồi giảm và chồi phát triển chậm [35]. Tương tự như kết quả nghiên cứu của Becerra và cs (2004), hiệu quả tái sinh chồi theo một khuynh hướng tuyến tính nghịch đảo liên quan đến tuổi của mẫu [29]. Hơn nữa, nghiên cứu của Chattopadhyaya và cs (2010) trên đối tượng Sesamum indicum L., khi các mẫu tTCL đoạn thân ở các vị trí đốt thân khác nhau (từ vị trí 1 đến 4) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L NAA kết quả cho thấy, những mẫu tTCL đoạn thân có nguồn gốc từ vị trí đốt thân thứ 1 (gần chồi đỉnh) và đốt thân thứ 4 cho hiệu quả tái sinh chồi thấp nhất; hiệu quả tái sinh chồi cao nhất thu được ở những mẫu tTCL đoạn thân có nguồn gốc từ đốt thân thứ 3 [35]. Kết quả thu được trong thí nghiệm này cũng ghi nhận tương tự như các nghiên cứu trước đây; mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và mẫu lTCL-T giống chanh dây vàng được thu nhận từ vị trí đốt thân thứ 3 (vị trí phần giữa) cho hiệu quả tái sinh chồi cao nhất; trong khi, các vị trí đốt thân thứ 1 (gần chồi đỉnh) và vị trí đốt thân thứ 5 (xa vị trí chồi đỉnh) cho hiệu quả tái sinh chồi thấp nhất thể hiện thông qua chỉ tiêu như tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu và chiều cao chồi (cm).

3.1.2.5. Ảnh hưởng của giá thể

Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy hiệu quả tái sinh chồi khác nhau khi sử dụng giá thể nuôi cấy khác nhau (agar; bông gòn; gelrite) ở cả giống chanh dây tím và vàng (Bảng 3.10 và Bảng 3.11). So với giá thể gelrite và bông gòn, agar là giá thể nuôi cấy thích hợp nhất cho khả năng cảm ứng tái sinh chồi từ mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng.

Đối với giống chanh dây tím, mẫu tTCL-L được nuôi cấy trên giá thể agar cho tỷ lệ tái sinh chồi (100%), số chồi (4,33 chồi/mẫu) và chiều cao chồi (1,57 cm) là cao nhất; trong khi đó, trên giá thể gelrite cho thấy tTCL-L chết sau 8 tuần nuôi cấy (Bảng 3.10 và Hình 3.11).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL-L giống

Giá thể	Tỷ lệ tái sinh chồi (%)	Số chồi	Chiều cao chồi (cm)
Gelrite	0,00c*	0,00b	0,00c
Bông gòn	46,67b	1,67b	0,37b
Agar	100,00a	4,33a	1,57a

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 242 trang tài liệu này.

chanh dây tím sau 8 tuần nuôi cấy.

Ghi chú: * Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 theo phép thử Duncan.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh chồi từ lTCL-T giống

Bông gòn	48,33b	2,33b	0,27b
Agar	88,33a	3,33a	1,43a

chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy.Giá thể Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi Chiều cao chồi (cm) Gelrite 31,67c* -1 -

Ghi chú: * Những chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 theo phép thử Duncan. 1 là cụm chồi gồm các chồi có kích thước rất nhỏ (< 1 mm).

Hình 3.11. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL-L giống chanh dây tím sau 8 tuần nuôi cấy.

Hình 3.12. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh chồi từ lTCL-T giống chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy.

Đối với giống chanh dây vàng, mẫu lTCL-T được nuôi cấy trên 3 giá thể (agar; bông gòn; gelrite) đều tái sinh chồi; tuy nhiên, so với giá thể bông gòn và gelrite, giá thể agar là thích hợp hơn với tỷ lệ tái sinh chồi (88,33%), số chồi (3,33

chồi/mẫu) và chiều cao chồi (1,43 cm) đạt cao nhất (Bảng 3.11). Mặt khác, trên giá thể agar, mẫu lTCL-T không xuất hiện hiện tượng cảm ứng hình thành mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy; trong khi đó, sự hình thành mô sẹo lại xuất hiện trên giá thể bông gòn và gelrite (Hình 3.12).

Giá thể nuôi cấy thường sử dụng các chất làm đông (agar, gelrite,…) là các chất trơ về mặt hóa học, sinh học và có đặc tính ổn định trong mọi điều kiện để giúp nâng đỡ mẫu, hấp thụ dinh dưỡng trong môi trường của mẫu. Agar, một polysaccharide thu được từ các loại rong biển, được sử dụng phổ biến như là một chất tạo đông trong môi trường nuôi cấy mô thực vật vì nó trơ về mặt sinh học, có độ ổn định cao, không phản ứng với các thành phần của môi trường và không bị phân hủy bởi các enzym thực vật [128]. So với agar, gelrite là polymer sinh học tinh chiết từ nuôi cấy vi khuẩn Sphingomonas elodea, không chứa tạp chất như agar nên gần như trong suốt và là chất tạo ra gel cứng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với agar. Trong khi đó, bông gòn là giá thể có độ thoáng khí, độ trơ về mặt hóa học cao, có nguồn gốc từ cây bông vải Gossypium herbaceum và đã được sử dụng làm giá thể trong một số nghiên cứu; tuy nhiên chưa có nghiên nào cho thấy hiệu quả của nó trong nuôi cấy mô [6]. Nên việc lựa chọn chất làm đông trong môi trường nuôi cấy cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây trong quá trình nhân giống in vitro, cũng như phụ thuộc vào loài khác nhau [43], [124]. Môi trường phải đủ cứng, chắc để hỗ trợ cho mẫu cấy, nhưng nếu độ cứng quá cao nó có thể ngăn chặn sự hấp thu các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy [43]. Nghiên cứu này cho thấy, chất làm đông trong môi trường đã thay đổi quá trình phát sinh hình thái từ mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy. Hiệu quả tái sinh chồi cao nhất được ghi nhận trên giá thể agar; trong khi đó, giá thể gelrite lại không mang lại hiệu quả tái sinh chồi trong thí nghiệm này. Tương tự với kết quả của Lim và cs (2012) trên đối tượng cây cúc (Chrysanthemum) với giống Moon Light, mô sẹo có thể hình thành 2,17 chồi/mẫu mô sẹo trên môi trường rắn với giá thể agar; trong khi mô sẹo không thể cảm ứng hình thành chồi trên môi trường rắn với giá thể agarose, gelrite [97].

3.1.2.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng

Điều kiện chiếu sáng (16 giờ/ngày; tối hoàn toàn) không chỉ ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái chồi mà còn ảnh hưởng đến sự cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua phát sinh mô sẹo từ mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy (Bảng 3.12, 3.13 và Hình 3.13, 3.14).

Sau 8 tuần nuôi cấy, dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, mẫu tTCL-L giống chanh dây tím nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BA, 30 g/L sucrose và 8,0 g/L agar cho tỷ lệ tái sinh chồi trực tiếp cao (100,00%). Chiều cao trung bình của chồi (1,13 cm) cao hơn so với trong điều kiện tối hoàn toàn (0,47 cm). Hơn nữa, dưới điều kiện này, mẫu tTCL-L vừa phát sinh hình thái chồi và vừa phát sinh mô sẹo; tuy nhiên, tỷ lệ phát sinh mô sẹo thu được là rất thấp và không đáng kể, chỉ đạt 4,44% (Bảng 3.12 và Hình 3.13). Ngược lại, trong điều kiện tối hoàn toàn, mẫu tTCL-L cho cảm ứng phát sinh hình thái mô sẹo (100,00%) sau 2 tuần nuôi cấy. Sau 6 tuần nuôi cấy tiếp theo kết quả cho thấy, trong số 100,00% mẫu phát sinh mô sẹo thì chỉ có 71,11% mẫu phát sinh hình thái chồi gián tiếp thông qua mô sẹo (Bảng 3.12). Trong khi đó, số chồi trung bình của mẫu ở 2 điều kiện chiếu sáng khác nhau thì không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê với p < 0,05 trong phép thử LSD (Bảng 3.12).

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL-

Điều kiện	Tỷ lệ phát sinh	hình thái (%)	Số	Chiều cao
chiếu sáng	Chồi	Mô sẹo	chồi/mẫu	chồi (cm)
16 giờ/ngày	100,00 ± 0,00 *	4,44 ± 1,11	4,33 ± 0,33	1,13 ± 0,33
Tối hoàn toàn	71,11 ± 2,22	100,00 ± 0,00	3,33 ± 0,33	0,47 ± 0,33

L giống chanh dây tím sau 8 tuần nuôi cấy.

Ghi chú: * Giá trị trung bình ± SE có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 theo phép thử LSD.

Trong khi đó, mẫu lTCL-T giống chanh dây vàng tái sinh chồi trực tiếp dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với tỷ lệ tái sinh chồi là 87,78% sau 8 tuần nuôi cấy, và quan sát không có mẫu cho cảm ứng phát sinh hình thái mô sẹo. Thế nhưng, dưới điều kiện tối hoàn toàn kết quả cho thấy, 54,44% mẫu lTCL-T cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp và 12,22% mẫu cảm ứng hình thành mô sẹo. Ngoài ra, chiều cao

trung bình của chồi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày (1,37 cm) cao hơn so với điều kiện tối hoàn toàn (0,33 cm); trong khi, số chồi trung bình của mẫu ở 2 điều kiện chiếu sáng thì không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê với p < 0,05 trong phép thử LSD (Bảng 3.13 và Hình 3.14).

Điều kiện	Tỷ lệ phát sinh hình thái (%)		Số	Chiều cao
chiếu sáng	Chồi	Mô sẹo	chồi/mẫu	chồi (cm)
16 giờ/ngày	87,78 ± 2,22 *	0,00 ± 0,00	3,67 ± 0,33	1,37 ± 0,33
Tối hoàn toàn	54,44 ± 1,11	12,22 ± 1,11	2,67 ± 0,33	0,33 ± 0,33

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tái sinh chồi từ lTCL- T giống chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy.

Ghi chú: * Giá trị trung bình ± SE có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 theo phép thử LSD.

Quan sát hình thái giải phẫu từ mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng dưới 2 điều kiện chiếu sáng khác nhau (16 giờ/ngày và tối hoàn toàn) cho thấy, chồi được tái sinh trực tiếp từ mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày là chủ yếu (Hình 3.13c1, c2 và 3.14c1, c2). Trong khi đó, dưới điều kiện tối hoàn toàn, chồi được tái sinh gián tiếp thông qua mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện thông qua các giai đoạn: sau 2 tuần, mô sẹo được cảm ứng (Hình 3.13d1 và 3.14d1); hình thái cấu trúc sơ khai của chồi được hình thành từ mô sẹo sau 4 tuần (Hình 3.13d2 và 3.14d2); chồi hoàn chỉnh được hình thành sau 6 tuần và 8 tuần (Hình 3.13d3, d4 và 3.14d3, d4).

Ảnh hưởng của ánh sáng có liên quan đến loài, có loài thích hợp với thời gian chiếu sáng dài, trung bình, thấp hay tối hoàn toàn. Thời gian chiếu sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý của cây trồng [50]. Hơn nữa, ánh sáng cũng ảnh hưởng lên sự phát sinh cơ quan, tái sinh chồi cũng như sự hình thành mô sẹo và phôi. Ánh sáng đóng một vai trò quan trọng trong con đường quang hợp của thực vật thông qua ảnh hưởng đến các thụ thể cảm quang [82]. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng, cả mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng được nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi dường như ít nhạy cảm hơn với các điều kiện chiếu sáng. Sự cảm ứng tái sinh chồi xuất hiện dưới cả điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và điều kiện tối hoàn toàn, mặc dù tỷ lệ tái sinh

chồi, chiều cao trung bình của chồi dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày đều cao hơn so với dưới điều kiện tối hoàn toàn. Kết quả này phù hợp với nhận định của Lercari và cs (2002); Bhatia và Ashwath (2005) trên cây cà chua, mẫu lá mầm có thể cảm ứng tái sinh chồi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn [95], [31] . Điều này có thể thuyết phục rằng chất điều hòa sinh trưởng thực vật điều khiển thay thế tín hiệu trung gian của ánh sáng. Các quá trình điều tiết ánh sáng có thể được thay thế bởi sự tác động các cytokinin ngoại sinh. Cytokinin đã điều chỉnh gene AtpC, một gene quy định ánh sáng [31]. Điều ngược lại cũng đúng, cơ chế điều hòa phản ứng ARR4 của Arabidopsis, một gen phản ứng cytokinin sớm, cũng được cảm ứng để phản ứng với ánh sáng đỏ theo cách phụ thuộc phytochrome B. Tuy nhiên, cơ chế chính xác của cytokinin thúc đẩy phản ứng không có có sự kích thích của ánh sáng (trong tối hoàn toàn) vẫn chưa hiểu đầy đủ [31].

Hơn nữa, trong điều kiện tối hoàn toàn, mẫu có sự hình thành chồi thông qua mô sẹo; trong khi đó, ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, mẫu chủ yếu được cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp không thông qua mô sẹo, mô sẹo hình thành với tỷ lệ thấp (4,44%). Kết quả của nghiên cứu này tương tự như nghiên cứu Vieira và cs (2014) trên đối tượng P. setacea D.C [160]. Ở Passiflora, các con đường phát sinh hình thái chồi, mô sẹo ghi nhận được bằng cách điều chỉnh các điều kiện chế độ ánh sáng và chất điều hòa sinh trưởng. Một số nghiên cứu cho thấy rằng, chồi bất định thường không được hình thành trong điều kiện tối hoàn toàn [25], [122], [60]. Trong khi, đối với giống táo “Freedom”, mẫu tTCL đoạn thân được nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi và đặt dưới điều kiện ánh sáng huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày sau 4 tuần đầu cho thấy, những chồi đầu tiên bắt đầu hình thành và tiếp tục đặt dưới điều kiện ánh sáng huỳnh quang sau 3 tuần tiếp theo cho tỷ lệ tái sinh chồi tăng cao hơn so với mẫu tTCL đoạn thân được đặt dưới điều kiện tối hoàn toàn trong suốt 3 tuần đầu tiên và 4 tuần tiếp theo trong điều kiện ánh sáng huỳnh quang [46].

Như vậy, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày dưới ánh sáng đèn huỳnh quang là điều kiện thích hợp cho cảm ứng tái sinh chồi của mẫu tTCL-L giống chanh dây tím và lTCL-T giống chanh dây vàng.

Hình 3.13. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL- L giống chanh dây tím sau 8 tuần nuôi cấy. bar: 1 cm (a, a1, b, b1); bar: 100 µm (c1, c2); bar: 65 µm (d1, d2, d3, d4).

Hình 3.14. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tái sinh chồi từ lTCL- T giống chanh dây vàng sau 8 tuần nuôi cấy. bar: 1 cm (a, a1, b, b1); bar: 100 µm (c1, c2); bar: 65 µm (d1, d2, d3, d4).