Đánh giá hiệu quả can thiệp cộng đồng phòng, chống nhiễm sán lá gan nhỏ của người dân tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định năm 2009 - 2012

(2) ĐỊNH LOÀI ẤU TRÙNG NANG (METACERCARIA) THU THẬP ĐƯỢC Ở CÁ

1. Đối tượng: Mẫu ký sinh trùng sử dụng định loại sinh học phân tử là các ấu trùng nang (metacercaria) thu thập được ở cá nuôi tại thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định.

2. Phương pháp sinh học phân tử (PCR): định loại ấu trùng nang (metacercaria) thu thập được ở cá.

Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cồn 70% được lấy ra và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết. Hàm lượng ADN sử dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 microlit) là khoảng 150 nanogam

Thiết kế và tổng hợp mồi PCR

Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) là gen ty thể được chọn làm đích nghiên cứu. Cặp mồi (primer) dùng trong nhân bản ADN đích bằng phản ứng PCR (polymerase chain reaction), được thiết kế trên cơ sở các trình tự bảo tồn của gen cox1 có trong Ngân hàng Gen, bao gồm mồi xuôi: JB3F: 5'TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT3', và mồi ngược: JB4.5R:

5'TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG3', Các trình tự tương ứng với đoạn ADN nghiên cứu từ một số quần thể thuộc họ Opisthorchiidae và giống Paragonimus đã được công bố [4] và đăng ký tại Ngân hàng Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)được sử dụng để so sánh đối chiếu chạy PCR, giải trình tự và chọn chuỗi so sánh ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR trên máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm các bước như sau: 940C - 5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940C - 1 phút, 500C - 1 phút và 720C - 1 phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút ở 720C. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) và được dòng hoá vào vector

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 204 trang tài liệu này.

pCR2.1 của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.). Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào IVN F’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và RUSSELL, 2001). ADN của plasmid có chứa PCR được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.). Chuỗi ADN được giải trình tự trên máy giải trình tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) và thực hiện với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác. Sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9 và MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.). Trình tự axit amin được dịch mã theo bảng mã di truyền mt-DNA số 21 của sán dẹt (platyhelminth mtDNA genetic code) giới thiệu trong Ngân hàng Gen.

Các chuỗi cox1 của Clonorchis sp của Việt Nam sẽ được so sánh với các loài của Trung Quốc và Triều Tiên.

Phụ lục 5. VẬT LIỆU VÀ KỸ THUẬT PHÂN LOẠI ẤU TRÙNG SÁN LÁ TRONG CÁ NGỌT

1. Quan sát ấu trùng sán (metacercaria)

- Để phân loại được metacercaria dựa vào đặc điểm hình thái thu riêng những ấu trùng có hình dạng tương tự vào trong các đĩa petri nhỏ.

- Chuyển metacercaria sang lam kính, nhỏ một giọt glycerine + lactic acid (1:1), đậy lam men và quan sát hình thái chi tiết dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn (10x40 trở lên).

- Phân loại metacercaria dựa vào những đặc điểm hình dạng và kích thước. Những dấu hiệu phân loại quan trọng là:

+ Dạng ấu trùng và không phải là ấu trùng;

+ Các giác bám, kích thước giác và kích cỡ ấu trùng;

+ Hình dạng và kiểu tuyến bài tiết;

+ Cơ quan sinh sản.

2. Phá nang metacercaria

- Ép cơ học: Đôi khi ép rất nhẹ nang metacercaria dưới lam men với nước hoặc nước muối sinh lý có thể làm vỡ được ngan của metacercaria. Một kỹ thuật khác mà có thể làm là làm vỡ nang với đầu kim nhỏ thao tác dưới kính hiển vi.

- Tiêu nang bằng dung dịch dạ dày: Phương pháp của Li và ctv (2004):

+ Chuẩn bị dung dịch dạ dày như sau:

Trong dung dịch nước muối đệm phosphate ở pH 8,0 thêm: Trypsin 10 milligrams/100ml;

Muối mật 10 milligrams/100ml;

Để dung dịch dạ dày ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, hút metacercaria cho vào dịch này đặt trong tủ ấm 5% CO2 37oC. Metacercaria sẽ phá nang và thoát ra trong vòng 10 đến 90 phút.

3. Quy trình cố định và nhuộm Cố định Metacercaria:

a) Để nghiên cứu hình thái học nên được cố định trong formalin 5% nóng (hơ formalin cho tới khi gần sôi rồi bỏ ra ngoài, dùng pipet hút metacercaria cùng với ít nước hoặc nước muối sinh lý (càng ít càng tốt) cho trực tiếp vào formalin trong khi dung dịch này vẫn còn rất nóng. Nếu có thể nên thao tác trong buồng hút hoặc phòng có thông gió hoạc bên ngoài (Formalin 5%: 5 phần formaldehyde và 95 phần nước).

b) Để nghiên cứu phân tử DNA, cố định trong dung dịch cồn 70oC.

Cố định sán trưởng thành và metacercaria đã thoát khỏi nang

- Làm phẳng nhẹ dưới lamen trước khi cho vào dung dịch cố định formaline nóng 5%. Sau khi đặt trùng lên lam kính, đậy lamen và rút nước vừa phải bên dưới lamen bằng cách đặt miếng giấy hoặc giấy thấm vào mép lamen, nước sẽ tự động rút ra ngấm qua giấy. Không ép quá mạnh. Dùng pipet lấy formalin nóng 5% rồi nhỏ vào một bên mép của lamen bên dưới có trùng, formalin sẽ nhanh chóng chảy dưới lamen và cố định trùng. Cẩn thận nhấc lamen lên và rửa trùng bằng pipet trong dung dịch cố định formalin.

Phụ lục 6. TÀI LIỆU TRUYỀN THÔNG DÙNG TRONG CAN THIỆP CỘNG ĐỒNG