Phụ lục 3: Báo cáo kết quả điều chế cao định lượng từ rễ củ Tam thất
I. NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI, HOÁ CHẤT
1.1. Nguyên liệu
Các mẫu Tam thất
- Tam thất chưa chế: mẫu Tam thất được sấy khô, nghiền thành bột
- Tam thất chế: bột Tam thất được hấp ở nhiệt độ 120ºC trong 8 giờ
1.2. Dung môi, hoá chất
Dung môi dùng cho chiết xuất: ethanol (CN)
Dung môi, hoá chất dùng cho phân tích: Acetonitril, methanol, acid phosphoric (Merck), nước cất 2 lần
1.3. Thiết bị dụng cụ
Máy chiết và máy cô chân không đa năng (Daihan, Hàn Quốc). Bình chiết và cô thu hồi có dung tích 20 lít và 10 lít.
Hệ thống máy HPLC (Shimadu, Nhật Bản)
II. PHƯƠNG PHÁP
2.1. Phương pháp điều chế cao chiết
Cân khoảng 1 kg dược liệu, chiết hồi lưu với dung môi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1 (thể tích/khối lượng), 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Gộp các dịch chiết, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao đặc.
Hiệu suất chiết cao đặc từ dược liệu được xác định dựa trên công thức:
Mcao x (100-acao) x 100H= Mdl x (100-adl)
Trong đó: H: hiệu suất chiết cao (%)
Mcao, Mdl: khối lượng cao, khối lượng dược liệu (g) acao, adl: độ ẩm cao, độ ẩm dược liệu (%)
2.2. Định lượng một số saponin chính trong các cao chiết Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 15,0mg mỗi chất đối chiếu, hòa tan riêng trong 5ml methanol, thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 3mg/ml. Phối hợp các dung dịch chuẩn gốc thu được dung dịch hỗn hợp chuẩn. Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn với methanol, thu được các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thích hợp.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 200mg cao chiết, thêm ethanol 70%, siêu âm cho tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm dung môi đến vạch.
Các dung dịch chuẩn và dung dịch thử được lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm trước khi triển khai sắc ký.
Điều kiện sắc ký:
Hệ thống HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản Nhiệt độ buồng cột: 28°C
Tốc độ dòng: 1,0ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20µl Bước sóng phát hiện: 205nm
Pha tĩnh: Cột Agilent C18 (250 x 4,6mm; 5µm)
Pha động: acetonitril (A) – Acid phosphoric 0,1% trong nước (B), rửa giải theo chương trình sau:
Acetonitril (%) | Acid phosphoric 0.1% trong nước (%) | |
0-20 | 20-22 | 80-78 |
20-45 | 22-46 | 78-54 |
45-55 | 46-55 | 54-45 |
55-70 | 55 | 45 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Wei, G., Dong, L., Yang, J., Zhang, L., Xu, J., Yang, F., Cheng, R., Xu, R., & Chen, S. (2018), “Integrated Metabolomic And Transcriptomic Analyses Revealed The -
Wilkins, R. C., Kutzner, B. C., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., & Mclean, J. -
Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm của rễ củ Tam thất Panax notoginseng Burk. F.H. Chen, Araliaceae trồng ở Việt Nam trước và sau chế biến - 26
Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.
Tiến hành:
Tiêm các dung dịch hỗn hợp chuẩn, ghi nhận sắc ký đồ. Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của các chất đối chiếu và nồng độ của chúng trong dung dịch.
Tiêm các dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ.
Hàm lượng một chất trong mẫu Tam thất được xác định dựa trên công thức:
Trong đó:
X (%)= Y-bx H x k x 25x 100 A m x 1000 100-a
X: hàm lượng chất cần phân tích tính theo khối lượng cao khô kiệt (%) Y: diện tích pic của chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu thử
A,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn, xác định bằng thực nghiệm H: độ tinh khiết của chất đối chiếu (tính theo diện tích pic)
k: hệ số điều chỉnh thực nghiệm m: khối lượng cao chiết (mg)
a: độ ẩm của cao chiết (%)
III. KẾT QUẢ
3.1. Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu
Bảng 1: Hiệu suất chiết cao từ các mẫu dược liệu
Khối lượng (g) | Độ ẩm dược liệu (%) | Khối lượng cao (g) | Độ ẩm cao (%) | Hiệu suất chiết (%) | |
Mẫu chưa chế | 988,00 | 4,30 | 468,70 | 9,90 | 44,66 |
Mẫu đã chế | 970,00 | 13,05 | 372,78 | 6,60 | 41,28 |
3.2. Định lượng các mẫu cao chiết
3.2.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Tiến hành sắc ký như mô tả ở mục 2.2, thu được sắc ký đồ như hình 1.
Hình 1: Sắc ký đồ các cao Tam thất
A: Hỗn hợp mẫu chuẩn
B: Cao chiết từ mẫu Tam thất chưa chế C: Cao chiết từ mẫu Tam thất chế
Hình ảnh trên sắc ký đồ cho thấy với điều kiện sắc ký đã chọn, các chất cần phân tích cho các pic tách nhau rõ ràng, có thể dùng để định lượng các mẫu nghiên cứu.
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành như đã mô tả ở mục 2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 2. và hình 2.
Bảng 2: Kết quả xây dựng đường chuẩn
Diện tích pic | ||||||
Rg1 | Re | Rb1 | Rh1 | Rd | Rg3 | |
50 | 237420 | 203246 | 248534 | 367547 | 213028 | 314887 |
100 | 482741 | 411054 | 577000 | 881443 | 376099 | 615333 |
250 | 1194066 | 1022877 | 946749 | 1783151 | 929541 | 1491191 |
750 | 3562974 | 3055435 | 2633396 | 5134706 | 2639867 | 4283532 |
1000 | 4782154 | 4099647 | 3611931 | 6889350 | 3544766 | 5693495 |
1250 | 6285688 | 4690307 | 4245554 | 8146239 | 4381079 | 6951359 |
1500 | 7972059 | 5341087 | 5073620 | 9795781 | 5276054 | 8323176 |
Phương trình đường chuẩn | y=5181.3 x-124483 | y=3661.5 x+126065 | y=3304.7 x+163421 | y=6470.5 x+184682 | y=3486.9 +39266 | y=5524.3 x+86267 |
R2 | 0.9955 | 0.9917 | 0.9982 | 0.9987 | 0.9999 | 0.9997 |
|
Hình 2: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của các saponin đối chiếu
Dựa trên bảng 2 và hình 2, có thể thấy cả 6 chất cần phân tích đều có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ với nồng độ trong dung dịch. Vì vậy có thể dùng phương pháp này để xác định hàm lượng các chất trên trong các mẫu cao Tam thất chưa chế biến và đã chế biến.
Kết quả định lượng các mẫu cao được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả định lượng các cao chiết từ Tam thất
Độ ẩm (%) | Hàm lượng các chất trong cao (%) | |||||||
Rg1 | Re | Rb1 | Rh1 | Rd | Rg3 | Tổng | ||
Cao chiết từ Tam thất chưa chế | 9,90 | 11,70a ± 0,16b | 1,81 ± 0,01 | 14,89 ± 0,18 | 0,30 ± 0,01 | 3,23 ± 0,08 | 0,38 ± 0,01 | 32,32 ± 0,41 |
Cao chiết từ Tam thất chế | 6,60 | ND | ND | 5,30 ± 0,07 | 2,57 ± 0,12 | 0,83 ± 0,03 | 16,16 ± 0,07 | 24,62 ± 0,20 |
Ghi chú: a: hàm lượng trong mẫu (%), b: độ lệch chuẩn (%, n=3), ND: không phát hiện được
Phụ lục 4: Phiếu phân tích và kiểm nghiệm cao chiết Tam thất
