Phần Trăm Hàm Lượng Cao Của Các Cao Chiết Phân Đoạn Lá Đắng

1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [138], cấu trúc của CDE5 đã được khẳng định là quercetin.

Hình 3.15. Cấu trúc của quercetin (CDE5)

3.4.3. Nghiên cứu các cao chiết phân đoạn lá đắng

3.4.3.1. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn lá đắng

Cao cồn lá đắng sau khi tách chiết qua các dung môi phân cực khác nhau, chúng tôi thu được các cao phân đoạn tương ứng có khối lượng khác nhau được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá đắng

Bột khô	CC	CHe	CEtOAc	CBuOH
Khối lượng (g)	2000	200	100	60	30
Phần trăm hàm lượng cao (%)			50	30	15

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 205 trang tài liệu này.

CHe lá đắng chiếm tỷ lệ cao nhất (50%), tiếp đến là CEtOA (30%) và CBuOH (15%). Các cao phân đoạn này sẽ được sử dụng để cho chuột ĐTĐ type 2 uống, từ đó sàng lọc ra phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết tốt. Kết quả nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi cho các uống cao chiết phân đoạn lá chè đắng thể hiện trên bảng 3.9.

Bảng 3.9. Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân đoạn lá đắng

Lô (n = 10)

Nồng độ đường huyết (mmol/l)
Ngày 0	Ngày 3	Ngày 7	Ngày 14	Ngày 21
Đối chứng	21,03 ± 1,39	22,65 ± 1,40	25,20 ± 1,33	24,54 ± 2,88	26,76 ± 3,06
CHe	22,05 ± 1,31	22,85 ± 1,31	24,88 ± 1,36	26,72 ± 1,64	26,16 ± 3,02
CEtOAc	21,50 ± 1,49	19,45 ± 1,61	15,85 ± 1,76*#	13,12 ± 1,47**#	9,92 ± 0,76**#
CBuOH	20,06 ± 0,99	18,00 ± 1,18	14,36 ± 1,01**#	11,39 ± 1,02**#	8,94 ± 0,67**#

Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 10, *p < 0,05, **p < 0,01 (p so với thời điểm trước khi điều trị của cùng nhóm); #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng thời điểm khảo sát)

Từ kết quả thí nghiệm được trình bày ở trên ta có thể thấy, CHe có khối lượng cao nhất tuy nhiên lại không có tác dụng hạ đường huyết qua các thời điểm khác nhau (p > 0,05). Trong khi đó cao CEtOAC và CBuOH có tác dụng hạ đường huyết khá rò sau 7 ngày chuột được điều trị khi so với nhóm đối chứng cùng thời điểm khảo sát (p

< 0,01). Tác dụng hạ đường huyết của CEtOAC và CBuOH tốt nhất vào ngày 14 và 21 (p < 0,01). Cụ thể chuột cho uống CEtOAC có nồng độ đường huyết giảm đáng kể từ 21,50 mmol/l về 9,92 mmol/l, tương tự CBuOH từ 20,06 mmol/l về 8,94 mmol/l.

3.4.3.2. Phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất từ cao phân đoạn lá đắng có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất

Chúng tôi tiến hành phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất để từ đó góp phần chứng minh tác dụng hạ đường huyết của lá đắng. Qua thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được CEtOAC và CBuOH cho thấy hoạt tính hạ đường huyết tốt. Tiến hành phân lập trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thuận và pha đảo với các hệ dung môi phù hợp và chúng

tôi đã thu được một số hợp chất tinh sạch để tiến hành xác định cấu trúc.

* Phân lập chất

Phần CEtOAc (40 g) được tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải bằng hexan-ethyl acetate (9:1→0:1) và tách được 8 phân đoạn. Các phân đoạn 4 đến 6 được nạp lên cột silica gel và sử dụng CHCl3-MeOH (4:1) làm hệ dung môi rửa giải để thu được kết tinh màu vàng xuất hiện trong các lọ, tiến hành lọc rửa và kết tinh lại nhiều lần thu được hợp chất LĐE (12 mg).

30 g cao CBuOH được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột với dung môi rửa giải là CH2Cl2-MeOH (9:1→0:1) thu được 8 phân đoạn. Từ phân đoạn 4 tinh chế tiếp tục trên cột RP-18 với dung môi rửa giải là acetone-H2O (1:1,5→1,5:1) xuất hiện các kết tinh màu trắng, tiến lọc kết tinh và thu được hợp LĐB (64 mg).

* Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập

a. Cynaroside (LĐE)

Hợp chất LĐE được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C21H20O11 dựa trên kết quả phổ ESI- MS đo ở kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 448,9 ion hóa âm [M

- H]- với píc ion phân tử m/z 446,9. Phổ 13C, DEPT-NMR (phụ lục 6) của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 21 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học ở δC 181,8 ppm; sáu tín hiệu của nhóm methine ở δC 99,5; 94,7; 103,1; 113,5; 115,9 và 119,1 ppm; một nhóm methylene ở δC 60,6 ppm; bốn tín hiệu của nhóm oxymethine có độ dịch chuyển trong khoảng từ 69,5 – 77,1 ppm; bảy tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ MS và NMR của hợp chất LĐE có dạng phổ của một hợp chất flavonoid glycoside. Trên phổ 1H -NMR của hợp chất LĐE xuất hiện hai tín hiệu tách vạch doublet của hai proton ghép cặp meta tại δH 6,44 (1H; d; J= 2,0 Hz) và δH 6,78 (1H; d; J= 2,0 Hz) tương ứng với tín hiệu của 2 nguyên tử carbon tại δC 99,5 và 94,7 ppm trên phổ HSQC đặc trưng cho sự có mặt của 2 proton H-6 và H-8 của vòng A flavonoid; một tín hiệu singlet tại δH 6,73 (1H;

s) tương ứng với tín hiệu của nguyên tử carbon tại δC 103,1 trên phổ HSQC đặc trưng cho sự có mặt của proton H-3 của vòng C. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 3 tín hiệu doublet của proton thơm tại δH 7,41 (1H; d; 2,0 Hz); 6,91 (1H; d; 8,5 Hz) và 7,45 (1H; dd; 2,0; 8,5 Hz) được gán cho ba vị trí H-2’, H-5’ và H-6’ tương ứng của vòng

B. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một phân tử đường: tín hiệu doublet của proton anomeric tại δH 5,08 (1H; d; J= 7,5 Hz) cùng với các tín hiệu khác của các nhóm oxymethin trong vùng 3,26 – 3,71 ppm. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất LĐE (phụ lục 6) tương tự như số liệu phổ NMR của hợp chất Luteolin-7-O-β-glucopyranoside (cynaroside) đã được Wang và cộng sự phân lập từ loài Salvia officinalis [152]. Các tương tác trên phổ HMBC giữa các tín hiệu của proton anomeric của phân tử đường ở δH 5,08 (1H; d; 7,5 Hz; H-1”) với C- 7 (δC 162,9) và giữa δH 6,78 (1H; d; 2,0 Hz; H-8) với C-1” (δC 99,9) đã khẳng định vị trí của phân tử đường -O-β-glucopyranoside ở C-7 (trên hình 3.16). Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1D và 2D của NMR của hợp chất LĐE và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [152], cấu trúc của hợp chất LĐE đã được xác định là hợp chất cynaroside (hình 3.16).

Hình 3.16. Cấu trúc của cynaroside (LĐE)

b. Vernonioside E (LĐB)

Hợp chất LĐB thu được dưới dạng bột màu trắng và công thức phân tử của nó được xác định là C35H54O12 dựa trên kết quả phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS với píc ion phân tử m/z 667,3693. Phổ 1H-NMR của LĐB (bảng 3.10) cho thấy các tín hiệu sau: hai tín hiệu proton olefinic ở δH 5,36 (1H, br s) và 4,23 (1H, d, J = 7,0 Hz), ba tín hiệu proton methyl bậc ba ở δH 0,47 (3H, s); 0,82 (3H, s); 1,34 (3H, s) và hai nhóm proton methyl đính với cacbon bậc 2 ở δH 0,88 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,87 (3H, d, J = 6,5 Hz). Tín hiệu của proton anomeric của phân tử đường ở δH 5,34 (1H; d; J = 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT (phụ lục 7) cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của năm methyl, năm cacbon bậc bốn, hai olefinic, chín nhóm methine-oxigenate, bảy methine và bảy methylene. Các số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất LĐB tương tự như dữ liệu phổ của vernonioside B2 [89] ngoại trừ tín hiệu của nhóm methoxyl

tại C-28 đã được thay thế bởi nhóm –OH, điều này cho thấy rằng hợp chất LĐB có thể là một steroid glucoside mới thuộc khung stigmastane. Sự hiện diện của một phân tử đường β-glucoside tại C-3 của aglycone đã được xác định bằng cách so sánh với dữ liệu phổ NMR được công bố trong tài liệu [89] và tương tác trên phổ HMBC giữa các tín hiệu của proton anomeric H-1' (δH 4,23; d, 7,5 Hz) với C-3 (δC 74,8), C-3' (δC 76,8), C-5' (δC 76,7). Các tương quan trên phổ HMBC từ H-18 (δH 0,47) đến C-12 (δC 40,6), C-17 (δC 54,7), C-13 (δC 42,7) và C-14 (δC 48,0); từ H-19

(δH 0,82) đến C-1 (δC 33,7), C-10 (δC 35,5), C-9 (δC 143.3) và C-5 (δC 38,5); đã khẳng

định vị trí hai nhóm methyl ở C-10, C-13. Sự hiện diện của hai tín hiệu carbon ở δC 80,3 (C-24) và 109,1 (C-28) và các tương tác trên phổ HMBC giữa hai tín hiệu doublet của proton methyl ở δH 0,88 (3H, d, H-26) và 0,87 (3H, d, H-27) đến carbon ở δC 80,3 (C-24) và δC-25 (C 31,7), từ tín hiệu δH 1,34 (3H, d, H-29) đến δC 109,1 (C-

28) và C-24 ( δC 80,3), chỉ ra rằng có một nhóm methyl và một isopropyl lần lượt ở vị trí C-24 và C-28 (hình 3.20) ở vòng bên giống như của vernonioside B2. Các tương tác trên phổ HMBC từ H-7 (δH 5,36) đến C-9 (δC 143,3) và C-14 (δC 48,0); từ H-11 (δH 5,48) đến C-8 (δC 135,3), C-10 (δC 35,5) và C-13 (δC 42,7) đã chỉ ra rằng hai liên kết đôi ở tại vị trí C-7/C-8 và C-9/C-11. Sự vắng mặt của tín hiệu methoxyl tại C-28 và độ dịch chuyển hóa học của carbon C-28 (δC 109,1) về vùng trường cao đã chỉ ra rằng nhóm methoxyl của vernonioside B2 đã được thay thế bằng -OH (bảng 3.10). Như vậy, cấu trúc phẳng của hợp chất LĐB đã được xác định, phổ 1H-1H COSY-NMR đã chứng minh rò ràng mối liên kết của C-23-C-22-C-20-C-17-C-16-C-15-C- 14 và C-20-C-21. Sự dịch chuyển hóa học của H-14 (δH 2,40) phần lớn được dịch chuyển từ vernonioside A1, nhưng gần với vernonioside A2 [89], [88]. Điều này cho thấy nhóm hydroxy tại C-16 có cấu hình α [93]. Hơn nữa, cấu hình của nhóm 16-hydroxy có được nhờ sự dịch chuyển hóa học gần của Me-18 (δH 0,47) và H-15 (δH 1,92) so với vernonioside A2 [93], [88]. Mối tương quan NOESY giữa H- 3 (δH 4,16) và H-5 (δH 1,35), H-5 (δH 1,35) và H-14 (δH 2,40), H-14 (δH 2,40) và H-17 (δH 1,87), Me-18 ( δH 0,47) và Me-19 (δH 0,82), cũng như Me-18 (δH 0,47) và H-21 (δH 5,36) chỉ ra rằng LĐB chứa các vòng trans của bộ

khung chính, H-3, H-5, H -14 và H-17 có cấu hình α, trong khi Me-18, Me-19 và H-21 có cấu hình β. Mối tương quan trên phổ NOESY từ H-23 (δH 4,46) đến H-21 (δH 5,36) và H-22 (δH 4,63) chỉ ra rằng proton H-22 và H-23 có cấu hình β . Do đó, cấu trúc hợp chất 1 đã được xác định và đặt tên là vernonioside E (hình 3.18).

Bảng 3.10. Các số liệu phổ của vernonioside E

Vernonioside E (LĐB)
*δC	δ a C	δ a (mult., J = Hz) H
1	35,2	33,7	1,17 (1Ha, m), 1,81 (1Hb, m)
2	29,7	29,2	1,44 (1Ha, m), 1,86 (1Hb, m)
3	77,1	74,8	4,16 (br d, 7,0)
4	34.9	34,1	1,22 (1Ha, m), 1,78 (1Hb, m)
5	38,9	38,5	1,35 (1H, m)
6	29,9	29,4	1,79 (1Ha, m), 1,91 (1Hb, m)
7	121,8	120,5	5,36 (1H, br s)
8	135,7	135,3	-
9	143,7	143,3	-
10	36,0	35,5	-
11	118,6	118,1	5,48 (1H, d, 7,0)
12	41,1	40,6	1,94 (1Ha, m), 2,09 (1Hb, m)
13	43,1	42,7	-
14	48,5	48,0	2,40 (1H, m)
15	34,9	34,1	1,66 (1Ha, m), 1,92 (1Hb, m)
16	76,7	76,3	3,55 (1H, m)
17	54,9	54,7	1,87 (1H, m)
18	14,3	13,9	0,47 (3H, s)
19	19,7	19,2	0,82 (3H, s)
20	47,9	47,2	2,04 (1H, m)
21	98,4	98,0	5,36 (1H, br s)
22	80,2	79,3	4,63 (1H, br d, 6,0)
23	90,2	90,1	4,46 (1H, d, 6,0)

Vernonioside E (LĐB)
*δC	δ a C	δ a (mult., J = Hz) H
24	81,3	80,3	-
25	31,7	31,7	1,95 (1H, m)
26	17,5	16,8	0,88 (3H, d, 6,5)
27	18,4	18,1	0,87 (3H, d, 6,5)
28	112,4	109,1	-
29	17,5	23,1	1,34 (3H, s)
1’	101,4	100,9	4,23 (1H, d, 7,5)
2’	75,5	73,5	2,89 (1H, m)
3’	80,2	76,8	3,06 (1H, m)
4’	72,9	70,1	3,02 (1H, m)
5’	77,2	76,7	3,04 (1H, m)
6’	61,6	61,1	3,40 (1Ha, m), 3.63 (1Hb, m)
28-OCH3	48,2

Hình 3.17. Chất tinh sạch LĐB (trái) và

sắc kí bản mỏng của vernonioside E (LĐB) (phải)

Hình 3.18. Cấu trúc của vernonioside E (LĐB)

3.4.4. Khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng

Một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để điều trị bệnh ĐTĐ, đặc biệt là bệnh ĐTĐ type

2 là làm giảm đường huyết sau ăn bằng cách ức chế các enzyme thủy phân carbohydrate trong đường tiêu hóa, trong đó có enzyme α-amylase và glucosidase có liên quan đến việc phân hủy chuỗi dài của tinh bột. Các chất ức chế enzyme này làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate, gây giảm hấp thu đường và do đó làm giảm đường huyết sau ăn [96].

Để tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính hạ đường huyết của cao chiết lá chè dây và lá đắng, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α-amylase và α- glucosidase của các hợp chất đã được tinh sạch để xác định cơ chế hạ đường huyết của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Sự ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng

Mẫu

α-amylase (IC50 µM)	α-glucosidase (IC50 µM)
Acarbose	211,35  4,305	187,41  0,80
Quercetin	136,58 6,77	10,64  1,62
Myricetin	86,31  4,91	9,20  0,04
Myricitrin	9,64  0,68	8,92  3,65