Định Lượng: Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (Dđvn V

PHỤ LỤC 16: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHẤT CHUẨN SIGMA NYSTOSE

PHỤ LỤC 17: QUY TRÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE

1. Mục đích

Quy định phạm vi trách nhiệm và nội dung các bước thực hiện việc kiểm tra chất lượng để thiết lập chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

2. Phạm vi áp dụng

Được áp dụng tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương bởi những cán bộ đã được đào tạo phù hợp.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

3. Tài liệu tham khảo

 Dược điển Việt Nam V

 Thủ tục Thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn/ống chuẩn độ: VKN/TT/06.20

4. Trách nhiệm

Tất cả các cán bộ có liên quan đến việc thiết lập, hiệu chuẩn và bảo quản chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phải thực hiện đúng theo quy trình này.

5. Nội dung

Cấu trúc hoá học của nystose

Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-2-[[(2R,3S,4S,5R)-2-

[[(2R,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4- dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

Công thức phân tử: C24H42O21 Khối lượng phân tử: 666,58

5.1. Mục đích sử dụng: Sử dụng trong các phép thử định tính và định lượng bằng

phương pháp phân tích hóa lý.

5.2. Mô tả

Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước.

5.3. Tiêu chuẩn chất lượng

5.3.1. Định tính

A. Phương pháp phổ hồng ngoại (DĐVN V – Phụ lục 4.2)

Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của nystose chuẩn và có các đỉnh đặc trưng: 3406, 1652, 1458, 1325, 1132, 1059, 999 cm-1.

B. Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V – Phụ lục 5.3)

Trong phần định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic nystose trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.

5.3.2. Mất khối lượng do làm khô: (Phương pháp TGA)

Yêu cầu: Không quá 2,5%

- Thiết bị: Máy phân tích nhiệt trọng lực TGA.

- Chương trình gia nhiệt: 25ºC đến 105ºC, tốc độ gia nhiệt 10˚C/phút, giữ ở 105ºC trong 180 phút.

- Lượng mẫu thử: Khoảng 5,0 mg chế phẩm.

5.3.3. Nhiệt độ nóng chảy: (DĐVN V – Phụ lục 6.7)

Yêu cầu: 134 – 135 oC

5.3.4. Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (DĐVN V – Phụ lục 5.3).

Yêu cầu: Chế phẩm phải chứa không dưới 97,0% nystose (C24H42O21), tính theo nguyên trạng.

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: RP18 Ultra (250 mm x 4,6 mm, 5 µm).

- Pha động: Methanol - Nước (3 : 97).

- Detector ELSD: Nhiệt độ hoá hơi: 90 ºC; Độ phát hiện: Gain 6; Áp suất khí

nitơ: 3,5 bar.

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

- Thể tích tiêm: 10 µl.

* Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10,0 mg chuẩn nystose, hòa tan và định mức thành 10,0 ml dung dịch bằng pha động. Lấy 4,0 ml dung dịch, pha loãng và định mức thành 10,0 ml bằng pha động.

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10,0 mg nguyên liệu nystose, hòa tan

và định mức thành 25,0 ml dung dịch bằng pha động.

* Tiến hành

- Độ thích hợp của hệ thống sắc ký: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và Ln(diện tích pic) của pic nystose trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %. Số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không thấp hơn 2.000.

- Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi thời gian lưu và diện tích của các pic nystose.

* Tính toán kết quả

- Hàm lượng (%) nystose (C24H42O41), tính theo nguyên trạng trong nguyên liệu

được tính theo công thức:

trong đó:

𝑋 (%) = 𝑒

(ln 𝑆 × 𝑙𝑛𝐶𝑐 )

𝑇

𝑙𝑛𝑆𝐶

𝑚 × 1000

1000

× 100

SC: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn ST: diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch thử CC: nồng độ nystose trong dung dịch chuẩn (µg/ml)

m: lượng cân mẫu thử (g).

5.3.5. Tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN V – Phụ lục 5.4).

Yêu cầu: Không quá 1 %

Điều kiện sắc ký:

- Bản mỏng: Silica gel GF254.

- Dung môi khai triển: Ethyl acetat – nước- acid formic – acid acetic (6 : 3 : 2 :

2).

- Thuốc thử hiện vết: Thêm từ từ 11 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc (TT) vào 89 ml ethanol (TT), thêm 2,75 g α-naphthol và 7 ml nước, trộn đều.

Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch đối chiếu:

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn nystose trong methanol có nồng độ 0,05 mg/ml.

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10 mg chế phẩm, hoà tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol.

- Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,0 ml dung dịch thử và pha loãng thành 100 ml bằng methanol.

Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được khoảng ¾ bản mỏng, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và phun thuốc thử hiện vết, sấy bản mỏng ở 110 ºC trong 3 phút.

Đánh giá: Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường, bất kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử cũng không được đậm màu hơn vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1 %).

5.4. Hoá chất, thuốc thử

5.4.1. Chất chuẩn

Chất chuẩn nystose hãng Sigma Aldrich

5.4.2. Cột sắc ký:

RP18 Ultra (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)

5.4.3. Hoá chất, dung môi

- Methanol (TT)

- Nước cất (TT).

5.5. Nghiên cứu độ ổn định

Độ ổn định chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose được nghiên cứu dựa trên các tiêu chí sau:

* Định lượng:

- Tiến hành thử nghiệm trên 06 thử của ít nhất 3 lọ khác nhau.

- Phương pháp thử theo Mục 5.3.4.

- Yêu cầu: Hàm lượng chất chuẩn không sai khác quá 1,0 % so với hàm lượng chuẩn công bố; Giá trị (%) RSD  1,0 %.

* Tạp chất liên quan:

- Tiến hành kiểm tra trên 3 lọ (ống) mẫu thử riêng biệt

- Phương pháp thử theo Mục 5.3.5.

- Yêu cầu: Hàm lượng tạp chất phải đạt theo yêu cầu của Mục 5.3.5.

5.6. Bảo quản

Chất chuẩn Dược điển Việt Nam nystose được bảo quản tại kho lạnh bảo quản chất chuẩn, điều kiện nhiệt độ 2 oC – 8 oC và tránh ánh sáng.

PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ KIỂM TRA DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH THEO

DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V

Tiến hành kiểm tra chất lượng 4 mẫu Ba kích BK1, BK3, BK4 và BK5 theo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Việt Nam V, kết quả thu được như sau:

1. Mô tả

Rễ hình trụ tròn hay hơi dẹt, cong queo. Mặt ngoài màu nâu xám hoặc nâu nhạt, có nhiều vân dọc và ngang. Nhiều chỗ nứt ngang sâu tới lõi gỗ. Mặt cắt có phần thịt dày màu tím xám hoặc màu hồng nhạt, giữa là lõi gỗ nhỏ màu vàng nâu, vị hơi ngọt và hơi chát.

Hình ảnh 4 mẫu Ba kích sau khi loại bỏ rễ con, rửa sạch và sấy tới khô ở nhiệt

độ 50 oC được trình bày tại Hình 1.

BK1 BK3

2. Vi phẫu:

BK4 BK5

Hình 1. Hình thái của dược liệu Ba kích

Dùng lưỡi dao lam cắt dược liệu thành từng lát mỏng 10 µm đến 20 µm. Ngâm các lát cắt vào dung dịch javen đến trắng, rửa sạch javen bằng nước cất. Tiếp tục

ngâm lát cắt trong dung dịch xanh methylen 0,02 % (TT) từ 30 giây đến 60 giây, rửa nhanh lát cắt bằng nước cất. Ngâm lát cắt trong dung dịch đỏ carmin 0,5 % (TT) tới khi thấy màu bắt rõ, rửa sạch lát cắt bằng nước cất.

Đặc điểm vi phẫu của 4 mẫu Ba kích như sau: Mặt cắt ngang hình tròn, cấu tạo từ ngoài vào trong gồm:

- Lớp bần gồm 2 đến 3 hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm, trong lớp bần thường có các tế bào chứa bó tinh thể calci oxalat hình kim.

- Tế bào mô cứng xếp liền nhau tạo thành vòng sát lớp bần.

- Mô mềm vỏ dày, cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn, các tế bào ở phần ngoài bị ép bẹp.

- Phía trong mô mềm là libe, gồm các tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục. Rải rác trong mô mềm và libe có các bó tinh thể calci oxalat hình kim.

- Gỗ gồm các mạch gỗ lớn xếp thành bó, các bó kết hợp với nhau tạo thành lõi hình sao 5, 6 cạnh. Trong mô gỗ có những đám tế bào không hóa gỗ.

Kết quả đặc điểm vi phẫu của 4 mẫu Ba kích được trình bày tại Hình 2, Hình 3, Hình 4 và Hình 5.