Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. HoPS được sản xuất bởi LAB 7

Bảng 1.2. Cấu trúc đơn vị lặp lại của EPS ở một số LAB 9

Bảng 1.3. Thành phần monosaccharide trong EPS của một số dòng L. plantarum .12

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy tăng cường CO2 42

Bảng 2.2. Các đoạn mồi được sử dụng phân tích Real-time qPCR 47

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng LAB được phân lập từ thực phẩm lên men 49

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường khác nhau lên năng suất EPS, mật số và tỷ lệ sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 64

Bảng 3.3. Mật số vi khuẩn probiotic được nuôi cấy trong môi trường MRS không đường có bổ sung EPS của L. plantarum VAL6 68

Bảng 3.4. Thay đổi biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của các thách thức môi trường so với điều kiện không gây stress 89

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 169 trang tài liệu này.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí phát sinh loài của L. plantarum so với một số LAB liên quan khác dựa trên trình tự 16S rRNA 4

Hình 1.2. Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn Gram dương 5

Hình 1.3. Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh (pyranose) của glucose và 5 cạnh (furanose) của fructose 8

Hình 1.4. Hoạt tính sinh học của EPS được sản xuất bởi LAB 15

Hình 1.5. Các cơ chế kháng khuẩn của EPS 16

Hình 1.6. Sơ đồ chi tiết về sản xuất EPS của LAB thông qua việc chuyển đổi đường lactose, galactose và glucose trong tế bào chất 19

Hình 1.7. Cấu tạo của nucleotide-đường 20

Hình 1.8. Sơ đồ sinh tổng hợp EPS trong L. lactis NIZO 21

Hình 1.9. Tổng hợp dextran bởi glycosyltransferase (dextran sucrase) 22

Hình 1.10. Sơ đồ tổ chức di truyền của cụm gen eps trong L. plantarum 28

Hình 1.11. Sơ đồ tổ chức di truyền của cụm gen eps trong các LAB khác nhau 28

Hình 1.12. Stress môi trường kích thích sản xuất EPS 33

Hình 1.13. Cơ chế điều hòa phiên mã chống lại stress môi trường ở vi khuẩn 37

Hình 3.1. Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn L6 dưới kính hiển vi quang học 49

Hình 3.2. Đặc điểm khuân lạc chủng vi khuẩn L6 50

Hình 3.3. Khả năng sản xuất EPS của các chủng LAB phân lập từ thực phẩm lên men 50

Hình 3.4. Kết quả BLAST SEARCH để phân loài chủng L6 51

Hình 3.5. Cây phát sinh loài của chủng L. plantarum VAL6 được xây dựng bằng cách so sánh trình tự 16S rRNA 52

Hình 3.6. Sản phẩm khuyếch đại PCR của gen recA 52

Hình 3.7. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt 53

Hình 3.8. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt 54

Hình 3.9. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được stress nhiệt ..55 Hình 3.10. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH 56

Hình 3.11. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH 57

Hình 3.12. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được gây stress pH

...................................................................................................................................57

Hình 3.13. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl 59

Hình 3.14. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl 59

Hình 3.15. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được stress NaCl60 Hình 3.16. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 61

Hình 3.17. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 62

Hình 3.18. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được nuôi cấy tăng cường CO2 62

Hình 3.19. Khả năng chống oxy hóa của các loại EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới các điều kiện stress môi trường 65

Hình 3.20. Hàm lượng protein trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới các điều kiện stress môi trường 66

Hình 3.21. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose;

(D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress nhiệt 70

Hình 3.22. Sắc ký đồ thành phần monosaccharide trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 sau 3 giờ gây stress ở 42 oC 71

Hình 3.23. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH 73

Hình 3.24. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl 74

Hình 3.25. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose và

(D) rhamnose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 76

Hình 3.26. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress nhiệt 79

Hình 3.27. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress nhiệt 80

Hình 3.28. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH 81

Hình 3.29. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH 82

Hình 3.30. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl 83

Hình 3.31. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl 84

Hình 3.32. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 85

Hình 3.33. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện tăng nồng độ CO2 86

Hình 3.34. Sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của stress môi trường 90

Hình 3.35. Mô hình đề xuất để nâng cao EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6

...................................................................................................................................91

Hình 3.36. Mối tương quan giữa tổng EPS và khả năng sống sót của L. plantarum

VAL6 trong quá trình sấy đông khô 94

TÓM TẮT

Luận án “Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum” được thực hiện nhằm mục đích xác định được điều kiện stress thích hợp kích thích khả năng sinh tổng hợp mạnh exopolysaccharide (EPS) ở Lactobacillus plantarum. Nghiên cứu đã thực hiện phân lập chủng L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp EPS cao từ thực phẩm lên men, đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường như nhiệt độ, pH, NaCl và sự tăng nồng độ CO2 lên quá trình sản xuất EPS, lên sự thay đổi thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen có liên quan đến tổng hợp EPS.

Từ nguồn thực phẩm lên men truyền thống tại An Giang (Việt Nam) đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus bản địa có khả năng sản xuất EPS cao và được định danh là Lactobacillus plantarum VAL6.

Thực hiện nuôi cấy dưới tác động của các điều kiện stress môi trường, nghiên cứu đã xác định được xác định được điều kiện stress thích hợp kích thích khả năng sinh tổng hợp mạnh EPS của L. plantarum. Năng suất EPS cao nhất (50,44 g/L) thu được ở điều kiện stress pH 3 trong 3 giờ.

Xác định mối tương quan giữa sản xuất EPS và khả năng sống sót đã chỉ ra rằng sự tăng sản xuất EPS dưới các điều kiện stress môi trường làm tăng rõ rệt sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình sấy đông khô. Tương ứng với lượng EPS thu được nhiều nhất, tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 ở điều kiện stress pH 3 cũng đạt cao nhất (30,72%), cao hơn 1.536 lần so với điều kiện không gây stress.

Phân tích thành phần monosaccharide của EPS bằng phương pháp sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa. Kết quả cho thấy stress môi trường làm thay đổi thành phần monosaccharide của EPS với sự tích tụ nhiều hơn của một số loại đường phổ biến (mannose, galactose, xylose,..) và đường hiếm (rhamnose, fucose,...). Cụ thể, EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 ở điều kiện nuôi cấy bình thường là heteropolysaccharide bao gồm các loại đường mannose (83,44%), glucose (14,01%), galactose (1,15%), arabinose (0,00%), rhamnose (0,71%) và xylose (0,67%). Sau khi gây stress, thành phần monosaccharide thay đổi bao gồm mannose (69,13-80,34%), glucose (12,55-23,60%), galactose (1,87-6,50%), arabinose (0,00-

8,96%), rhamnose (0,38-8,00%) và xylose (0,00-6,55%). Dưới điều kiện stress nhiệt còn tìm thấy sự hiện diện của fucose trong thành phần EPS.

Phân tích sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS bằng kỹ thuật Real-time qPCR, kết quả cho thấy stress môi trường có tác động làm tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS (glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J và cps4H), kết quả dẫn đến những thay đổi trong năng suất và thành phần monosacchride của EPS.

Các kết quả này cho thấy rằng stress môi trường có thể làm thay đổi quá trình sinh tổng hợp EPS ở vi khuẩn lactic (LAB). Ngoài ra, stress môi trường có thể được sử dụng để kích thích LAB sản xuất EPS mới có hoạt tính sinh học cao cho các ứng dụng công nghiệp.

ABSTRACT

The thesis, "Study on environmental stress conditions on the ability to synthesize exopolysaccharides of Lactobacillus plantarum" was carried out with the aim to determine the appropriate stress conditions that stimulate strong exopolysaccharide (EPS) biosynthesis in Lactobacillus plantarum. In this study, we isolated L. plantarum strain with high EPS biosynthesis ability from fermented foods and evaluated the effects of environmental stress conditions such as temperature, pH, NaCl, and increased CO2 concentration, on EPS production, changes in monosaccharide composition, and the expression of genes involved in EPS synthesis.

From traditional fermented foods in An Giang (Vietnam), a native strain of Lactobacillus with high EPS production capacity was isolated and identified as Lactobacillus plantarum VAL6.

Carrying out the culture under the influence of environmental stresses, the study discovered the appropriate stress condition that stimulates the strong EPS biosynthesis of L. plantarum. Accordingly, the maximum EPS yield (50.44 g/L) was obtained after 3 hours of stress at pH 3.

Observation of the correlation between the EPS production and survival indicated that increased EPS production under environmental stresses markedly increased bacterial survival during freeze-drying. Corresponding to the maximum amount of EPS produced, the freeze-dried survival of L. plantarum VAL6 stressed at pH 3 was also the highest (30.72%), 1,536 times higher than the normal culture condition.

Analysis of EPS monosaccharide composition was done using gas chromatography with a flame ionization detector. The analysis demonstrated that environmental stresses alter the monosaccharide composition of EPS, resulting in greater accumulation of some common sugars (mannose, galactose, xylose, etc.) and rare sugars (rhamnose, fucose, etc.). Specifically, the EPS produced by L. plantarum VAL6 under normal culture conditions are heteropolysaccharides consisting of sugars such as mannose (83.44%), glucose (14.01%), galactose (1.15%), arabinose (0.00%), rhamnose (0.71%), and xylose (0.67%). After stress, the monosaccharide composition changed including mannose (69.13-80.34%),

glucose (12.55-23.60%), galactose (1.87-6.50%), arabinose (0.00-8.96%), rhamnose (0.38-8.00%), and xylose (0.00-6.55%). Under heat stress conditions, the presence of fucose was also found in the EPS component.

Analyzing the mRNA expression of genes involved in EPS biosynthesis via Real-time qPCR, the results showed that environmental stresses could increase or decrease the expression of genes involved in EPS biosynthesis (glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J, and cps4H), resulting in changes in the yield and monosacchride composition of EPS.

These results suggested that environmental stresses could alter EPS biosynthesis in lactic acid bacteria (LAB). Furthermore, environmental stresses could be used to stimulate LAB to produce novel EPS which is highly bioactive for industrial applications.