Ảnh Hưởng Của Mật Độ Giống Đến Nhân Sinh Khối Ba Chủng Vi Khuẩn Hình 3.15

Các chủng vi khuẩnBacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối của vi sinh vật.

Khảo sát môi trường nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 được nhân giống trên 3 môi trường lỏng giàu dinh dưỡng là NB, LB và TSB ở nhiệt độ 37oC, tỷ lệ giống 1% với mật độ 107 CFU/mL.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối đến ba chủng vi khuẩn Trên hình 3.14, chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt

trên với trường NB so với hai môi trường LB và TSB, mật độ đạt cao nhất trên môi trường NB là 8,87 log.CFU/mL (7,5 x 108 CFU/mL). Hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 đều phát triển tốt trên môi trường TSB, với mật độ vi khuẩn lần lượt là 8,84 log.CFU/mL và 8,86 log.CFU/mL (6,9 x 108 CFU/mL và 7,2 x 108 CFU/mL). Qua xử lý thống kê, đối với từng chủng vi khuẩn, các môi trường được lựa chọn có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với 2 môi trường còn lại (phụ lục 2.5.1 – bảng 2.2).

Do đó, chọn môi trường NB để nhân sinh khối vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, môi trường TSB để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15.

Khảo sát ảnh hưởng mật độ đến nhân sinh khối các chủng vi khuẩn

Từ kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường nhân sinh khối, tiếp tục nuôi vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 trên môi trường NB, vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 trên môi trường TSB với thời gian

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 247 trang tài liệu này.

24 giờ, nhiệt độ 37oC, tỷ lệ giống là 1% với mật độ thay đổi từ 106, 107, 108, 109 CFU/mL.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của mật độ giống đến nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn Hình 3.15 cho thấy mật độ nhân giống của vi khuẩn Rhodococcus

rhodochrous T9, Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 có mật độ giống ban đầu 108, 109 CFU/mL là cao nhất, đạt 4,5 - 6 x 109 CFU/mL và qua xử lý thống kê cho thấy mật độ của 3 chủng vi khuẩn ở mật độ giống 108, 109 CFU/mL không có sự khác biệt về mặt thống kê với nhau nhưng có sự khác biệt đối với mật độ 106, 107 CFU/mL (P < 0,01) (phụ lục 2.5.1 – bảng 2.3). Do đó, để việc nhân sinh khối mang tính hiệu quả kinh tế thì chọn mật độ vi khuẩn đầu vào là 108 CFU/mL cho cả 3 chủng vi khuẩn.

Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến nhân sinh khối các chủng vi khuẩn

Nhân giống vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 trên môi trường NB, vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 trên môi trường TSB với nhiệt độ 37oC, tỷ lệ giống là 1% với mật độ vi khuẩn ban đầu 108 CFU/mL, khảo sát thời gian tăng sinh vi khuẩn theo các mốc thời gian 24, 36, 48, 60, 72 giờ.

Hình 3.16. Ảnh hưởng thời gian tăng sinh đến nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn

Hình 3.16 cho thấy mật độ của vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 với thời gian tăng sinh là 24, 36 giờ là gần như nhau, dao động khoảng 9,67 x 109 - 9,78 x 109 CFU/mL và cao hơn so với các thời gian 12, 48, 60 giờ. Xét về thống kê, thời gian tăng sinh giữa các mốc thời gian 24, 36 giờ không có sự khác biệt có ý nghĩa nhưng có sự khác biệt có ý nghĩa với mốc thời gian 12, 48, 60 giờ (phụ lục 2.5.1 – bảng 2.4). Mặc dù mật độ vi khuẩn của 3 chủng vi khuẩn ở thời gian 36 giờ cao hơn 24 giờ, tuy nhiên, để việc nhân sinh khối nhanh và có hiệu quả kinh tế, chọn mốc thời gian tăng sinh là 24 giờ cho vi khuẩn R. rhodochrous T9 (9,67 x109 CFU/mL), B. licheniformics B85 (9,7 x109 CFU/mL), P. stutzeri KL15 (9,7 x109 CFU/mL).

Tóm lại, chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 được tăng sinh trên môi trường NB, thời gian 24 giờ, tỷ lệ giống 1% với mật độ 108 CFU/mL. Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 được tăng sinh trên môi trường TSB thời gian 24 giờ, tỷ lệ giống 1% với mật độ 108 CFU/mL.

3.2.1.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm dạng lỏng

Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn

Sau khi có kết quả các điều kiện trong môi trường nhân giống ở mục 3.2.1.1, tiến hành nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 trên môi trường sản xuất (phụ lục 2.3) với thời gian 24 giờ, mật độ 108CFU/mL với tỉ lệ nạp giống lần lượt là 1%,

2,5%, 3,5% và 5%.

Hình 3.17 cho thấy mật độ vi khuẩn R.rhodochrous T9 là 9,5 x 109 CFU/mL(9,98 Log.CFU/mL), B.licheniformis B85 là 1010 CFU/mL(10,03 Log.CFU/mL), P. stutzeri KL15 là 1,19 x 1010 CFU/mL (10,07 Log.CFU/mL) khi

nuôi cấy với tỉ lệ nạp giống 2,5% có sự khác biệt có ý nghĩa với các tỉ lệ nạp giống còn lại (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.5). Do đó chọn tỉ lệ nạp giống 2,5% cho cả 3 chủng vi khuẩn ở các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn

Nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9, B.licheniformis B85, P.stutzeri KL15 trên môi trường sản xuất có tỉ lệ nạp giống 2,5% (mật độ 108CFU/mL), nhiệt độ 30oC, thời gian thay đổi từ 12, 24, 36, 48 giờ .

Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Hình 3.18 cho thấy mật độ vi khuẩn R.rhodochrous T9 là 1 x 1010 CFU/mL (10,01 Log.CFU/mL), B.licheniformis B85 là 1,1 x 1010CFU/mL (10,03 Log.CFU/mL), P.stutzeri KL15 đạt giá trị cao nhất là 1,64 x 1010CFU/mL (10,19

Log.CFU/mL). Sau khi xử lý thống kê (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.6), kết quả cho thấy mật độ của ba chủng vi khuẩn nuôi cấy trong thời gian 24, 36, 48 giờ không có sự khác biệt có ý nghĩa, tuy nhiên có sự khác biệt với thời gian là 12 giờ. Trên đồ thị, mốc thời gian 36 giờ có mật độ vi khuẩn cao nhất, do đó chọn thời điểm 36 giờ cho việc nhân sinh khối vi khuẩn cả 3 chủng vi khuẩn.

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn

Nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 trên môi trường sản xuất, tỷ lệ giống 2,5% (mật độ 108CFU/mL), thời gian 36 giờ với nhiệt độ thay đổi lần lượt là

30oC, 33oC, 35oC và 37oC.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Hình 3.19 cho thấy mật độ vi khuẩn B.licheniformis B85 là 1,2 x 1010 CFU/mL (10,07 Log.CFU/mL) ở 35o C, P.stutzeri KL15 đạt giá trị cao nhất là 1,75x1010 CFU/mL (10,23 Log.CFU/mL) khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC,

R.rhodochrous T9 là đạt cao nhất ở 330C với mật độ là 1,1 x 1010 CFU/mL (10,04 Log.CFU/mL) (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.7).

Vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 ở mức nhiệt độ 35o C lại có sự khác biệt có ý nghĩa với 33oC, không có ý nghĩa thống kê với 30 oC, 37 oC, do đó để việc sản xuất có hiệu quả kinh tế, chọn nhiệt độ 30 oC cho thí nghiệm tiếp theo. Đối với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 khi nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ từ 30 oC đến 37

oC, mật độ vi khuẩn tăng dần. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn khi nuôi cấy ở 37 oC

không có khác biệt có ý nghĩa so với các nhiệt độ 30, 33, 35o C do p >0,05. Mật độ vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 ở mức nhiệt độ 33oC có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với 35oC, 37oC nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa với 30oC, tuy nhiên xét về hiệu quả kinh tế thì chọn mức 30o C cho thí nghiệm tiếp theo.

Do đó, nhiệt độ nhân sinh khối vi khuẩn là 30oC được lựa chọn cho các thí

nghiệm tiếp theo nhằm giảm chi phí cho quá trình lên men nhân sinh khối Pseudomonas stutzeri KL15. Trong thí nghiệm lựa chọn nhiệt độ, ba chủng vi khuẩn đều được tăng sinh ở nhiệt độ phòng (30 o C).

Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn

Nhân sinh khối ba chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9, B.licheniformis B85, P. stutzeri KL15 trên môi trường sản xuất, tỷ lệ giống 2,5% (mật độ 108CFU/mL), thời

gian 36 giờ, nhiệt độ 30oC, pH thay đổi theo các mức như sau: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5.

Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Hình 3.20 cho thấy mật độ vi khuẩn R.rhodochrous T9 là đạt cao nhất ở pH 6,5 với mật độ là 1,13 x 1010 CFU/mL (10,05 Log.CFU/mL), B. licheniformics B85 là 1,1 x 1010 CFU/mL (10,03 Log.CFU/mL) ở pH 7,5. P.stutzeri KL15 đạt giá trị cao nhất là 1,1 x1010CFU/mL(10,02 Log.CFU/mL) khi nuôi cấy ở pH 7. Sau khi xử lý

thống kê (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.8), vi khuẩn B.licheniformis B85 ở mức pH 7,5 không có ý nghĩa thống kê với pH 6,5, 7,0, nhưng khác biệt có ý nghĩa với pH 6, do đó để việc sản xuất có hiệu quả kinh tế, chọn pH 7 cho thí nghiệm tiếp theo. Đối với vi khuẩn P.stutzeri KL15 ở mức pH 7 khác biệt có ý nghĩa với các mức pH còn lại, chọn pH 7 để nhân sinh khối vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL1. Mật độ vi khuẩn R.rhodochrous T9 ở mức pH 6,5 không có sự khác biệt có ý nghĩa với pH 7, khác biệt có ý nghĩa với mức pH 6 và 7,5. Tuy nhiên để việc lên men nhanh, tiết kiệm được chi phí, chọn pH 7 cho việc lên men chủng vi khuẩn này. Do đó, pH 7 được lựa chọn để lên men nhân sinh khối cả 3 chủng vi khuẩn các thí nghiệm sau.

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon

Ba chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 được tăng sinh trong môi trường sản xuất, tỷ lệ giống 2,5% (mật độ 108CFU/mL), nhiệt độ 30oC, thời gian 36 giờ và pH7. Môi trường sản

xuất vi sinh ban đầu có nguồn cacbon được sử dụng là glucose 10g/L, được thay thế bằng mật rỉ, maltosedextrine, sucrose với 10g/L.

Hình 3.21. Ảnh hưởng của Cacbon đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Hình 3.21 (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.9) cho thấy mật độ chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9 cao nhất 1,27 x 1010 CFU/mL (10,10 Log.CFU/mL) ở nguồn cacbon là glucose, kế đến là mật rỉ đường là 5,6 x 109 CFU/mL (9,75 Log.CFU/mL), tuy nhiên theo kết quả thống kê thì glucose có sự khác biệt ý nghĩa với các nguồn cacbon còn lại, do đó chọn glucose để lên men vi khuẩn.

Với nguồn cacbon là mật rỉ đường thì mật độ vi khuẩn B. licheniformics B85 cao nhất 1,3 x 1010 CFU/mL, kế đến là nguồn cacbon là glucose 1,25 x 1010CFU/mL.Tương tự, chủng vi khuẩn P.stutzeri KL15 cao nhất với nguồn cacbon là mật rỉ đường đạt 2,56 x 109 CFU/mL, sau đó đến glucose và maltodextrin. Xét về

thống kê, giữa hai nguồn cacbon là mật rỉ đường và glucose của hai chủng vi khuẩn không có sự khác biệt có ý nghĩa nhưng xét về giá trị kinh tế, mật rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền hơn glucose, rất thích hợp cho quá trình lên men thu nhận sinh khối vi khuẩn. Do đó, chọn nguồn cacbon là mật rỉ đường cho 2 chủng vi khuẩn B. licheniformics B85, P.stutzeri KL15, chọn glucose cho vi khuẩn R.rhodochrous T9 để tiếp tục thí nghiệm tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Sau khi chọn được nguồn cacbon cho 3 chủng vi khuẩn, môi trường sản xuất vi sinh ban đầu có nguồn nitơ là pepton 10g/L được thay thế bằng (NH4)2SO4, NaNO3 và cao nấm men với nồng độ 10 g/L. Hình 3.22 (phụ lục 2.5.2 – bảng 2.10) cho thấy thành phần nitơ là cao nấm men cho giá trị mật độ vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 cao nhất 1,28 x 1010 CFU/mL (10,11 Log.CFU/mL), kế đến là pepton (1,17 x 1010 CFU/mL tương ứng là 10,07 Log.CFU/mL), giữa hai nguồn nitơ này không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê, tuy nhiên xét về mật độ vi khuẩn thì cao nấm men cho kết quả cao hơn.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của Nitơ đến sinh khối ba chủng vi khuẩn

Trong các nguồn nitơ được khảo sát, cao nấm men có ảnh hưởng lớn nhất đến

mật độ vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15, đạt giá trị 1,31x1010 CFU/mL (10,08

Log.CFU/mL). Nguồn nitơ hữu cơ khác là peptone cho giá trị mật độ vi khuẩn thấp hơn, khoảng 7% so với nguồn cao nấm men. Trong khi đó, các nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 và NaNO3 không thích hợp cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15. Mật độ chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 cao nhất 1,08 x 1010 CFU/mL (10,03 Log.CFU/mL) ở nguồn nitơ là pepton 10g/L, có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nguồn nitơ còn lại. Vậy, chọn nguồn nitơ là cao nấm men cho 2 chủng vi khuẩn B. licheniformics B85, P.stutzeri KL15, pepton là nguồn nitơ cho vi khuẩn R.rhodochrous T9 để tiếp tục thí nghiệm tối ưu hóa môi trường sản xuất vi khuẩn.

Tóm lại, 3 chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9, B.licheniformis B85, P.stutzeri