Kết Quả Đánh Giá Khả Năng Chuyển Hóa Nitrite Của Các Chủng Vi Khuẩn Tuyển

bao gồm 5 giống khác nhau: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosobrio, Nitrozolobus và Nitrosospira (Waston và ctv, 1989; Bock and Koops, 1992; Herbert, 1999). Tuy nhiên, theo kết quả định danh sinh học phân tử trong nghiên cứu này đã xác định được các loài vi khuẩnStenotrophomonas pavanii, Chryseobacterium gleum, Stenotrophomonas maltophilia, Delftia lacustris, Acinetobacter junii, Rhodococcus rhodochrous, Arthrobacter nicotianae, Rhodococcus aetherivorans, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Oceanobacillus iheyensis là các chủng chuyển hóa NO2- trong môi trường nước mặn được phân lập từ bùn đáy ở vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa NO2- khác với một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn chuyển hóa trong ao tôm thẻ chân trắng, tôm sú trong nước và thế giới. Hiện nay, những nghiên cứu về nhóm vi sinh vật chuyển hóa NO2- trong bùn nuôi tôm hùm còn rất hạn chế, các loài vi khuẩn đã được xác định trong nghiên cứu này hiện vẫn chưa được đề cập đến việc chuyển hóa NO2- trong nuôi trồng thủy sản, tuy nhiên có một số nghiên cứu trên thế giới đã minh chứng đặc tính của vi khuẩn Acinetobacter sp. có khả năng chuyển hóa NO2- trong bùn của nước thải xử lý thực vật (Li, 2019), chủng vi khuẩn Delftia lacustris có khả năng phân hủy chất peptidoglycan trong tự nhiên (Jørgensen và ctv, 2009), chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia có khả năng sử dụng các hợp chất thơm (Urszula và ctv, 2009), chủng vi khuẩn Stenotrophomonas pavanii phân lập từ thân của một giống mía ở Brazil có khả năng cố định Nitơ (Ramos và ctv, 2011), chủng vi khuẩn Chryseobacterium gleum phân hủy dầu mỏ tại các vùng đất nhiễm xăng dầu (Đinh Thị Vân và Ngô Cao Cường, 2018), chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. được sử dụng làm probiotic cho cá hồng cam (Puntius conchonius), kết quả tăng trưởng về chiều dài, chiều rộng, trọng lượng của cá hơn hẳn nghiệm thức đối chứng, ngoài ra, màu sắc trong mô cá cũng khác so với đối chứng (Vianey và ctv, 2016). Chủng vi khuẩn Rhodococcus ruber tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học đã được phân lập tại nước ô nhiễm dầu ven biển Vũng Tàu (Lại Thị Hiền và ctv, 2013).

3.1.4.6. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Sau khi định danh các chủng vi khuẩn, 16 chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường định lượng nitrite, khảo sát từ 12 giờ - 72 giờ (bảng 1.10, phụ lục 1.4.6 trình bày sai số và trắc nghiệm phân hạng theo thời gian giữa các nghiệm thức). Hình 3.6 cho thấy khả năng chuyển hóa NO2 của nhóm vi khuẩn bắt đầu thích nghi ở giai đoạn 24 giờ, bắt đầu tăng cao sau 36 giờ. Ở thời điểm 48 giờ, hiệu suất xử lý của các chủng vi khuẩn đều tăng lên và đạt trên 80%, đến giai đoạn 60 -72 giờ thì hiệu suất chuyển hóa NO2 tăng nhẹ và đường biểu diễn gần như như nằm ngang.

Hình 3.6. Hiệu suất chuyển hóa NO2- của các chủng vi khuẩn

Sau 72 giờ, hiệu suất chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn là từ 66,5

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 247 trang tài liệu này.

% - 98,21%, trong đó có 11 chủng vi khuẩn CKT, C2/1, C2/2, C3/1, C4/2, TKT, T1, T2/2, T3/1, T4/1, T9 hiệu suất chuyển hóa nitrite trên 95%, chủng vi khuẩn T2/2 có hiệu suất xử lý cao nhất (98,21%) và chủng thấp nhất là T9 (95,05%). Theo Nguyễn Văn Minh (2012) đã phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn chuyển hóa nitrite 84,17% trong thời gian 7 ngày trong nước nuôi trồng thủy sản. Các dòng vi khuẩn NB1, NB2 và NB5 được phân lập từ bùn thải của bể xử lý sinh học thuộc khu liên hợp xử lý chất thải Nam Bình Dương có khả năng chuyển hóa nitrite (2 g/L) với hiệu suất tương ứng là 99,85%; 97,15% và 98,44% sau 24 giờ (Trần Ngọc Hùng và Huỳnh Thị Kim Trang, 2017). So sánh kết quả của nghiên cứu với các tác giả trên, các chủng vi khuẩn NOB trong nghiên cứu này có khả năng chuyển hóa chậm hơn các chủng vi khuẩn từ nước thải chăn nuôi, nhưng lại có kết quả chuyển hóa nitrite tốt hơn chủng vi khuẩn cùng phân lập trong nước nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra, đối với

các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitrite được phân lập tại nền đáy Vịnh Xuân Đài thì có kết quả tương tự với nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Thị Trúc Mai (2019), cho rằng nhóm vi khuẩn chuyển hóa NO2 được phân lập tại ao tôm thẻ chân trắng ở Bạc Liêu cho hiệu suất xử lý NO2 là 97,2% trong thời gian 3 ngày. Theo tác giả Shu Ma (2021), chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. phân lập từ nước thải lợn, chuyển hóa 85% ammonia với tốc độ là 3,4 mg/L ammonia trong 1 giờ. Do đó, để đánh giá được thời điểm xử lý NO2 mạnh nhất của từng chủng vi khuẩn cần phải tiến hành khảo sát tại các mốc thời gian liên tiếp nhau. Kết quả định lượng NO2 thấy, khả năng xử lý nitrite của mỗi chủng vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau là có sự khác biệt và tùy thuộc vào môi trường, chủng vi sinh vật.

3.1.5. Khảo sát khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và khả năng chịu mặn của các nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus, AOB và NOB.

- -

Sau khi đã phân lập và định danh 5 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus chuyển hóa ammonia trên 95%, 5 chủng vi khuẩn AOB chuyển hóa trên 80% và 11 chủng NOB chuyển hóa nitrite trên 95%, nhằm lựa chọn nhóm vi khuẩn để tiến hành cho nội dung 2, nhân sinh khối tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, tiến hành đánh giá các đặc tính khác của 21 chủng vi khuẩn trên như chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và khả năng chịu mặn ở nồng độ muối khác nhau.

3.1.5.1. Khảo sát khả năng chuyển hóa NO2 , NO3 và khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn AOB.

Kết quả định tính (bảng 1.11, phụ lục 1.6) cho thấy có 4 chủng vi khuẩn có khả

năng chuyển hóa cả NO - và NO -, đó là các chủng vi khuẩn Bacillus sp. B5, Bacillus

2 3

licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Alcaligenes faecalis KL33.

Hình 3.7. Hiệu suất chuyển hóa NO2- của 4 chủng vi khuẩn

Tiến hành định lượng khả năng chuyển hóa nitrite và nitrate của 4 chủng vi khuẩn, kết quả hình 3.7 cho thấy hiệu suất chuyển hóa nitrite của các nhóm vi khuẩn tăng sau hai ngày và tất cả các chủng vi khuẩn đều có hiệu suất chuyển hóa trên 90% sau 4 ngày. Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15, Bacillus licheniformis B85 chuyển hóa nitrite sau 4 ngày với hiệu suất là 99,06% và 96,97%.

Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp. B5, Alcaligenes faecalis KL33 có hiệu suất chuyển hóa nitrite trên 90% trong thời gian 4 ngày.

Hình 3.8. Hiệu suất chuyển hóa NO3 của 4 chủng vi khuẩn

Kết quả hình 3.8 cho thấy hiệu suất chuyển hóa nitrate của các nhóm vi khuẩn tăng sau hai ngày, tăng mạnh từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 3 và đến ngày thứ tư thì hầu như không tăng. Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15, Bacillus licheniformis B85 có khả năng chuyển hóa nitrate cao nhất sau 4 ngày với hiệu suất là 98,02 %, 89,63%. Hai chủng vi khuẩn Bacillus sp. B5, Alcaligenes faecalis KL33 có hiệu suất chuyển hóa nitrate là 63,87%, 52,12% sau 4 ngày.

Hình 3.9. Khả năng sống ở các nồng độ NaCl của 4 chủng vi khuẩn

Hình 3.9 (phụ lục 1.6 – bảng 1.16) cho thấy 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng sống ở các nồng độ muối từ 2% đến 7% và nồng độ muối càng cao thì mật độ các vi sinh vật càng giảm, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus sp. B5 có khả năng chịu mặn tốt nhất so với 3 chủng vi khuẩn còn lại.

Tác giả Rajakumar (2008) đã nghiên cứu hiệu quả giảm nitrate 99,4% của nhóm vi khuẩn Bacillus sp. và Pseudomonas sp. trong nước thải giàu nitrate ở nhiệt độ 30oC, pH 7. Tác giả Trịnh Hoài Vũ (2014) phân lập được 3 chủng vi khuẩn P.stutzeri có khả năng xử lý NH4+ với hiệu suất 77,4% - 86,75%, NO2- có hiệu suất 90,36 -98,79 %, NO3- có hiệu suất là 61,01% - 81,17% với thời gian là 96 giờ trong ao nuôi cá tra. Abdollahi-Arpanahi và ctv (2018) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm sinh học Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis về năng suất tăng trưởng, sinh lý học miễn dịch và phản ứng đề kháng của tôm thẻ chân trắng con (Litopenaeus vannamei) và kết luận rằng tôm được nuôi bằng men vi sinh cho thấy khả năng chống chịu với môi trường cao. Nhóm tác giả Hastuti (2019) đã định danh 3 chủng vi sinh vật chuyển hóa nitrite là Pantoea calida, Pseudomonas stutzerii và Halomonas sp. từ nước nuôi cua. Kết quả nghiên cứu khá phù hợp với các nghiên cứu hiện nay trong và ngoài nước.

Từ các kết quả trên, với tiêu chí là chọn chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa các hợp chất ammonia, nitrite, nitrate trên 80%, đã chọn chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 chuyển hóa ammonia trên 95% trong 24 giờ, chuyển hóa nitrite 96,97%, chuyển hóa nitate 89,63% trong 4 ngày và chủng vi khuẩn thứ 2 là Pseudomonas stutzeri KL15, có hiệu suất chuyển hóa ammonia 83,87% trong 7 ngày, chuyển hóa nitrite 99,06% trong 4 ngày, nitrate 98,02 % trong 4 ngày để tiến hành thí nghiệm cho nội dung tiếp theo.

3.1.5.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa NH4- và NO3- và khả năng chịu mặn của nhóm vi khuẩn NOB.

Từ 11 chủng vi khuẩn NOB chuyển hóa nitrite trên 95%, kết quả định tính ( phụ lục 1.6 - bảng 1.12) cho thấy có 4 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa cả NH4+ và NO3-, đó là các chủng vi khuẩn Chryseobacterium gleum CKT, Stenotrophomonas maltophilia T1, Stenotrophomonas pavanii T2/2, Rhodococcus

rhodochrous T9. Do đó, 4 chủng vi khuẩn trên được chọn tiến hành định lượng hàm lượng ammonia và nitrate để xác định hiệu suất xử lý.

Hình 3.10. Hiệu suất chuyển hóa NH4 của 4 chủng vi khuẩn

Hình 3.10 cho thấy hiệu suất chuyển hóa ammonia của 4 chủng vi khuẩn của các nhóm vi khuẩn tăng từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5. Đến ngày thứ 5, hiệu suất chuyển hóa ammonia của vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 tăng lên 86,21%, ngày thứ 6 thì hiệu suất chuyển hóa không tăng mà có dấu hiệu giảm nhẹ và không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Còn hiệu suất chuyển hóa ammonia của 3 chủng vi khuẩn còn lại đến ngày thứ 5 là 60%, qua ngày thứ 6 sự chuyển hóa ammonia không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với ngày thứ 5.

Hình 3.11. Hiệu suất chuyển hóa NO3- của 4 chủng vi khuẩn

Hình 3.11 cho thấy hiệu suất chuyển hóa nitrate của 4 chủng vi khuẩn tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3, ngày thứ tư hiệu suất chuyển hóa nitrate không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với ngày thứ 3. Sau 4 ngày, chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 có hiệu suất chuyển hóa nitrate là 81,24% và hai chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia T1, Stenotrophomonas pavanii T2/2 đều có hiệu suất chuyển hóa dưới 65%. Riêng chủng vi khuẩn Chryseobacterium

gleum CKT có hiệu suất chuyển hóa nitrate dưới 50% sau 4 ngày.

Kết quả nghiên cứu tương tự của tác giả Chen và ctv (2012) chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. chuyển đổi 85% ammonia thành nitrite, nitrate và khử nitơ trong 25 giờ, chứng tỏ chủng vi khuẩn thực hiện đồng thời quá trình nitrate hóa, khử nitơ trong xử lý nước. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Li (2013) cũng cho thấy Rhodococcus sp. có khả năng sử dụng ammonia và nitrate như nguồn nitơ khi được nuôi cấy trong môi trường tăng sinh.

Hình 3.12. Khả năng sống ở các nồng độ NaCl của 4 chủng vi khuẩn

Hình 3.12 (phụ lục 1.6 bảng -1.17) cho thấy 4 chủng vi khuẩn đều có khả năng sống ở các nồng độ muối từ 2% - 7%, nồng độ muối càng cao thì mật độ các vi sinh vật càng giảm, vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia T1 phát triển tốt nhất so với 3 chủng vi khuẩn lại. Tuy nhiên với mục tiêu là chọn lọc nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia, nitrate trên 80% trong thời gian 3-5 ngày để tiến hành tiếp tục cho nội dung 2, từ các kết quả trên, chỉ chọn được 1 chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 có chuyển hóa ammonia trên 86,21 % trong thời gian 5 ngày, chuyển hóa nitrite 95,01 % trong 3 ngày, chuyển hóa nitrate 81,24 % trong 4 ngày để tiến hành thí nghiệm cho nội dung tiếp theo.

Tóm lại, qui trình phân lập, định danh và tuyển chọn được ba chủng vi khuẩn từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm là vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 có khả năng chuyển hóa ammonia, nitrite và nitrate tốt nhất được thực hiện như hình 3.13.

Thu mẫu bùn từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài

P. stutzeri KL15

R. rhodochrous T9

B.licheniformis B85

Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trên môi trường lỏng ammonium - calcium - carbonate, bổ sung NaCl với thuốc thử Griess – Ilosway, 21 ngày ủ trong tối, 28oC

Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trên môi trường lỏng nitrite - calcium - carbonate,bổ sung NaCl với thuốc thử Griess Ilosway, 21 ngày ủ trong tối, 28oC

Phân lập trên thạch đĩa - MT TSA bổ sung NaCl

Định tính khả năng chuyển hóa ammonia bằng bộ kit Sera NH4/NH3

Xác định mật độ vi khuẩn theo bảng MPN

Thực hiện phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey

Phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch ammonium – calcium – carbonate sau 21 ngày ủ trong tối, 28oC

Phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch nitrite – calcium – carbonate sau 21 ngày ủ trong tối, 28oC.

Thực hiện phương pháp giải trình gen vùng 16S r-RNA

Định tính khả năng chuyển hóa ammonia bằng bộ kit Sera NO2

Định tính khả năng chuyển hóa ammonia bằng bộ kit Sera NH4/NH3

Khảo sát khả năng chuyển hóa ammonia bằng phương pháp Phenat

Thực hiện phản ứng sinh hóa bằng kit API

Thực hiện phương pháp giải trình gen vùng

16S r-RNA

Thực hiện phương pháp giải trình gen vùng

16S r-RNA

Khảo sát khả năng chuyển hóa ammonia bằng phương pháp Phenat

Khảo sát khả năng chuyển hóa nitrite bằng phương pháp Napthylamine

Hình 3.13. Qui trình phân lập 3 chủng vi khuẩn ở nền đáy vùng nuôi tôm hùm

3.2. Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và bột

3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men tạo chế phẩm dạng lỏng của các chủng vi khuẩn

3.2.1.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn