Khoảng Chuyển Dịch Hóa Học Các Dạng Carbon Chọn Lọc.

Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc.

2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh.

Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.

2.5.5 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis

Cường độ của tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert-Beer.

A = -lg(I/I0) = ɛ.l.C

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 86 trang tài liệu này.

Trong đó A: mật độ quang; C: nồng độ dung dịch (mol/l); l: chiều dài lớp dung dịch (chiều dày cuvet đựng mẫu), (cm); ɛ: hệ số hấp thu phân tử có thứ nguyên hay hệ số hấp thu mol đặc trưng cho cường độ hấp thu của chất nghiên cứu ở bước sóng đã cho (l/mol.cm); I: cường độ chùm sáng đi qua dung dịch; I0: cường độ chùm sáng đi qua dung môi.

Phương pháp quang phổ tử ngoại- khả kiến được áp dụng để xác định định tính (nhận biết), xác định định lượng, cấu trúc trong nghiên cứu phức chất.

Trong khuôn khổ đề tài này, rutin, quercetin và các phức hợp tương ứng được phân tích bằng phương pháp phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) trên máy CINTRA 40, GBC (Mỹ).

a) Xác định độ hòa tan của dược chất trước và sau khi tạo phức

Độ hòa tan của các dược chất được khảo sát theo thời gian trong môi trường pH 7,4 – tương ứng với môi trường vùng dịch tá tràng.

Trước khi xác định được độ tan của các dược chất ta cần phải xây dựng phương trình đường chuẩn của rutin trong dung dịch đệm pH 7,4. Phương pháp như sau: Tiến hành ghi phổ UV-Vis của các dung dịch RuT có nồng độ chính xác để xác định mật độ quang tại bước sóng cực đại 365 nm đối với RuT. Dựng phương trình phụ thuộc của mật độ quang với nồng độ dung dịch RuT tương ứng bằng phần mềm Origin.

Khảo sát độ tan của các dược chất: Một khối lượng chính xác của vật liệu được đưa vào bình có dung tích 500 ml chứa dung dịch đệm ở 370C. Sau các khoảng thời gian cố định (5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút) để lắng và hút chính xác 5 ml phần dung dịch phía trên bình phản ứng, lọc qua giấy lọc và đem đi đo phổ UV-Vis. Từ phương trình đường chuẩn đã xây dựng ở trên xác định được chính xác nồng độ của rutin trong dung dịch tại từng thời điểm lấy mẫu.

Độ hòa tan của các mẫu tại thời điểm t được tính toán như sau:

% hòa tan = m ở thời điểm t/ m chứa trong mẫu · 100%

b) Xây dựng giản đồ pha hòa tan

Giản đồ pha hòa tan được xây dựng theo phương pháp Higuchi-Connors [52]. Đây là phương pháp khá phổ biến trong hóa học phức chất siêu phân tử. Lượng dược chất dư được thêm vào 25ml các bình cầu có chứa CD với nồng độ dao động trong khoảng từ 0 đến 9mM. Lắc các ống nghiệm liên tục trong 24 giờ ở 25 ± 1oC. Để xác định nồng độ của hoạt chất đã hòa tan trong các mẫu, thu hồi và lọc qua màng có đường kính lỗ trống 0,45 μm. Sau đó pha loãng phần dung dịch thu được đến nồng độ cần thiết và xác định độ hấp thụ ở 256 nm (với rutin) và 370 nm (với quercetin) bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.

Hằng số bền của các phức chất (Ks) được xác định từ giản đồ pha của quá trình hoà tan theo phương trình sau:

Trong đó, S0 là độ hoà tan của dược chất ở 25oC khi không có cyclodextrin; Slope được xác định bằng hệ số góc từ đồ thị phụ thuộc nồng độ (mol/l) dược chất đã hòa tan với nồng độ (mol/l) của CD trên biểu đồ pha hòa tan.

2.5.6 Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai DSC

Đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) là một kỹ thuật cho phép nhận biết những hiện tượng năng lượng xảy ra trong quá trình làm nóng hoặc làm lạnh của một chất (hoặc hỗn hợp nhiều chất) và xác định biên thiên enthalpy, nhiệt dung riêng và nhiệt độ ở đó xuất hiện các hiện tượng này. Kỹ thuật được dùng để xác định chênh lệch tốc độ nhiệt giải phóng hoặc hấp thu bởi chất khảo sát so sánh với mẫu đối chiếu theo sự thay đổi của nhiệt độ.

Mục đích của phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) trong nghiên cứu này là đo biến đổi thành phần hóa học, chứng minh rutin và quercetin đã được bao bọc bởi các cyclodextrin.

Rutin, quercetin, cyclodextrin và các phức hợp được phân tích nhiệt bằng máy đo nhiệt lượng kế vi phân (DSC, DSC204F1 (NETZSCH-Germany). Cân chính xác các mẫu rắn (khoảng 3-4mg) trong chảo nhôm và quét từ nhiệt độ phòng

(25oC) đến 350°C với tốc độ gia nhiệt không đổi 10°C/phút trong môi trường khí trơ (ni-tơ).

2.5.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho phép kiểm tra hình thái học của vật chất bằng hình ảnh trực tiếp. Các kỹ thuật dựa trên kính hiển vi điện tử cung cấp nhiều ưu điểm trong phân tích hình thái và kích thước.

Hình thái cấu trúc của các hạt phức nano [RuT-βCD] và [Quer-HPβCD] được khảo sát bằng thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) số hiệu JSM-6510LV (Jeol, Nhật Bản). Các mẫu được phủ bạch kim trước khi đo.

2.5.8 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại (517 nm). Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao.

Quy trình thí nghiệm thực hiện như sau: Bổ sung 5 ml DPPH (0,18 mM, pha trong ethanol) vào mỗi ống nghiệm đã chứa 2 ml dung dịch hoạt chất tại các nồng độ khác nhau (4.10-6M – 83.10-6M), lắc đều và ủ 30 phút trong điều kiện không có ánh sáng. Sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại bước sóng 517 nm trên máy quang phổ UV-Vis. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu.

Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa được xác định theo công thức sau:

Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = %

Trong đó, ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử; ODc: giá trị mật độ quang OD của chứng âm.

Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa các mẫu. Mẫu nào có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.1 ĐẶC TRƯNG TÍNH CHẤT CỦA RUTIN VÀ QUERCETIN

3.1.1 Xác định cấu trúc rutin và quercetin

a. Sử dụng sắc ký lớp mỏng

(a) (b)

Hình 3.1: Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng rutin (hình

a) và quercetin (hình b). Trong đó 1-mẫu nghiên cứu; 2-mẫu đối chứng.

Rutin sau khi chiết suất và quercetin sau khi bán tổng hợp được đem đi phân tích bằng phương pháp sắc kí bản mỏng. Dễ dàng nhận thấy sự giống nhau giữa rutin, quercetin thu được từ nghiên cứu và chất chuẩn đối chứng; có thể kết luận sản phẩm thu được từ quá trình nghiên cứu là rutin và quercetin. Bên cạnh đó, sắc ký đồ cho hình ảnh hiển thị là hai chấm tròn rò nét, cho thấy sản phẩm thu được sau kết tinh có độ tinh sạch cao.

Sử dụng sắc ký bản mỏng là phương pháp đơn giản nhất để xác định quá trình chuyển hóa từ rutin sang quercetin đã kết thúc hay chưa.

(a) (b)

Hình 3.3: Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng khảo sát quá trình thủy phân rutin trong HCl 5% để thu được quercetin.

Hình 3.3a là sắc ký đồ khi chưa diễn ra quá trình thủy phân, hệ dung môi khảo sát hexane:ethanol (tỉ lệ thể tích 4/6) không đủ phân cực để làm rutin dịch chuyển nên rutin vẫn giữ nguyên ở điểm xuất phát. Hình 3.3b là sắc ký đồ khi quá trình thủy phân diễn ra trong 2 giờ, lúc này chỉ xuất hiện 1 chấm tròn ở phía trên. Đối chiếu quercetin thu được sau tinh chế với quercetin đối chứng bằng sắc ký bản mỏng cho kết quả giống nhau (hình 3.2b).

b. Kết quả phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Quercetin bán tổng hợp dạng bột màu vàng, điểm nóng chảy 313 - 314°C. Phổ 1H-NMR cho thấy hai tín hiệu doublet của hai proton thơm ở δH 6.18 (d, J = 2.0 Hz, H-6) và 6,40 ppm (d, J = 2.0 Hz, H-8). Ngoài ra, ba proton ở 7,67 (d, J = 2,5 Hz, H- 2'), 7,54 (dd, J = 7,5, 2,5 Hz, H-6') và 6,89 ppm (d, J = 8,5 Hz, H-5') cho thấy tín hiệu loại ABX. Phổ 13C-NMR cho thấy 15 tín hiệu trong khoảng δ 93,32-175,8 ppm của bộ khung flavonoid. Việc so sánh dữ liệu phổ với mẫu quercetin so sánh xác định hợp chất tổng hợp được là quercetin.

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của quercetin.

Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của quercetin.